空間轉錄組技術解析大腦皮層分子特征

哺乳動物的大腦皮層發揮著感知認知、意識運動、學習記憶等多種功能，這主要靠不同腦區復雜的神經元連接發揮著作用，要了解其中的機制，解析大腦皮層不同腦區的細胞類型組成是最基本的研究工作。隨著高通量測序技術的發展，尤其是2020年華大基因公司發布的空間轉錄組測序技術的誕生[1]，使得大腦的細胞研究從化學和物理水平向生物分子水平跨越了一大步。該技術不但能檢測神經細胞的分子特征，還能實現對細胞的精準定位，幫助我們更好地理解神經元與神經元、神經元與膠質細胞的分布規律及其互作方式，從而認識不同功能的腦區是如何協調運作的。

大腦皮層的結構和功能

大腦作為哺乳動物的最高級神經中樞，它通過神經元之間的連接，實現感知認知、意識運動、學習記憶等多種功能。包裹在大腦最外層的區域為大腦皮層，也稱為新皮層，它是維持大腦正常運作的核心區域，除了大腦皮層內部神經元的連接和信息的傳遞，還負責接收和傳遞皮層下腦區的信息。

高級哺乳動物的大腦皮層在外觀上有很大不同，主要表現在皮層中的溝回數目和深度，對于溝回的形成，有觀點認為：“溝回是大腦皮層在生長發育過程擠壓出來的，是為了容納更多的神經細胞。”大腦皮層可劃分為不同的區域，最早提出的是布羅德曼分區[2]；也可依據皮層所執行的功能，進一步劃分為9個功能區：前額葉皮層、額葉皮層、頂葉皮層、顳葉皮層、島葉皮層、枕葉皮層、聽覺皮層、軀體感覺皮層和扣帶回皮層。不同區域的腦區一般主要參與某一部分的工作，完整的工作往往需要不同腦區中的神經元互相協作發揮功能完成指令。如在查看學習資料的時候，枕葉中的神經元負責接受視覺信號，讀取信息后再將其傳輸至前額葉皮層，由前額葉進行高級的計算處理，歸納和總結所“見”資料，再把信號傳輸給其他負責記憶功能的腦區，才能完成整個學習過程。

新皮層作為哺乳動物大腦進化上最為復雜和顯著不同于其他動物的區域，具有獨特的6個分層[4]，由外向內依次為分子層（第Ⅰ層，含其他層神經細胞的軸突、樹突及少量神經元），外顆粒層（第Ⅱ層， 含小顆粒神經元），外錐體細胞層（第Ⅲ層，含小錐體神經元），內顆粒層（第Ⅳ層，顆粒神經元），內錐體層（第Ⅴ層，含大錐體神經元），多形層（第Ⅵ層，含少量大型錐體神經元，一些小紡錘形錐體神經元和多形態神經元）。其中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ層的神經元主要負責發送和接收信號，其中第Ⅲ層的細胞投射到相鄰的皮層區域，第Ⅱ層細胞可投射到更遠處的皮層區域。而第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層接受來自相鄰皮層神經元細胞的信號輸入，并可再將信號發送到皮層下核團，如丘腦。這是大腦皮層維持大腦正常運作的基本結構。

進化比較研究發現，靈長類動物腦區體積的增大，伴隨著神經元數量和大腦溝回數目的增加，同時也伴隨著新皮層的巨大擴張，新皮層中所包含的神經細胞數目遠超大腦其他區域，這也是當前認為人類和非人靈長類動物相比較嚙齒類動物，可以形成更高級認知功能的一個重要原因[5]。在腦的進化過程中，無論是大腦皮層中復雜結構的形成，還是高級動物獨有的6層分層結構，都說明理解大腦運作方式的必要條件是解析大腦皮層中的細胞組成，包括不同腦區下不同分層中的神經元組成。

大腦皮層中神經細胞的鑒定

神經科學研究的初期，主要通過解剖學以及后來發展起來的免疫組織化學技術，根據形態特征將細胞分類為神經細胞（神經元）、神經膠質細胞和非神經元。通過電生理技術記錄神經元的電信號，來分析這些神經元的功能。其中，負責激活下游神經元活性的細胞為興奮性神經元，反之抑制下游神經元活性的為抑制性神經元。

轉錄組測序是一種高通量測序技術，可用于檢測組織或細胞的基因表達水平。隨著轉錄組技術發展到單細胞、單核水平，大量研究開始基于RNA分子水平的特征來解析和比較不同腦區的細胞組成，對基因表達相似的神經元和非神經元進行分群，并定義出不同的細胞群，研究不同腦區的功能與其細胞組成或特定群神經元的聯系，識別神經性或精神疾病相關的細胞類型和基因，進一步研究它們與腦的認知、記憶等功能和腦疾病的關系。

當前對大腦皮層的細胞組成和分子特征的研究策略，包括：從關注特定功能的單個腦區到多個腦區的比較，進而對全腦進行解析，繪制全腦單細胞類型圖譜；從單物種到跨物種比較，在進化水平上理解人類具備更高級認知能力的原因。技術上的革新也逐漸從組織水平發展到單細胞水平的轉錄組技術，再跨越到分辨率更高、具有細胞定位的空間轉錄組技術。

2023年7月，中國科學院神經科學研究所與華大基因公司合作，使用空間轉錄組測序技術（Stereo-seq）和單細胞核轉錄組技術（snRNA-seq），捕獲了近150萬個單細胞核，收集了161張獼猴腦切片，基本覆蓋了獼猴大腦全皮層，獲得了世界首套單細胞分辨率獼猴大腦皮層細胞空間分布圖譜。該研究獲得了264個細胞類型的空間分布，發現大腦皮層不同區域的細胞組成與傳統的功能分區、皮層的層次結構（hierarchy）顯著相關；大量興奮性神經元、抑制性神經元和非神經元在大腦皮層的分布，呈現明顯的腦區或者層次的特異性；通過與已知的人腦和鼠腦單細胞數據的跨物種比較，發現了靈長類特有的分布于第四層的興奮性神經元，這些細胞高表達與人類疾病相關的基因，包括FOXP2、DCC和EPHA3等[6]。

2023年12月，腦科學計劃-細胞普查聯盟基于空間轉錄組技術、單細胞轉錄組技術和表觀基因組測序技術，報告了迄今為止最為全面和詳細的小鼠大腦細胞類型圖譜。這些成果表明，通過大規模高通量測序技術可幫助科學家進一步在分子水平上研究哺乳動物大腦的發育和進化，以及神經系統疾病相關的細胞類型和分子機制的鑒定。

空間轉錄組測序技術

空間轉錄組測序技術結合了顯微成像和常規轉錄組測序技術，在獲取細胞基因表達數據的同時，也獲取了該細胞的空間位置信息。常規轉錄組測序技術能通過捕獲細胞所釋放的mRNA分子，完成對基因表達的定量，實現在分子水平上對細胞的分群和注釋。然而，空間轉錄組測序技術還可以實現對所捕獲mRNA分子的原位定量，即可定位細胞的空間位置。大腦皮層中復雜的神經細胞組成和突觸連接是大腦正常工作的基礎，空間轉錄組測序更利于解析大腦這種復雜組織的異質性，在分子水平幫助解析大腦發育過程中不同細胞狀態的時空性，以及與神經性疾病發生的潛在機制。

根據其細胞定位方式、RNA捕獲和定量方法、引物序列設計等方面，空間轉錄組技術包含了4種主要技術類型[7]。

（1）基于顯微解剖的基因表達技術：其特點是手工操作的成本高、細胞通量低，如激光捕獲顯微切割技術，通過固定腦組織切片、顯微鏡定位、激光束切割目標區域，再提取切割的組織或細胞的RNA進行建庫測序。

（2）原位雜交技術：其原理是通過與mRNA雜交互補的單鏈RNA分子探針捕獲靶基因序列，并通過探針所攜帶的熒光基團或化學發光標記進行成像檢測，使原位的基因表達可視化，其特點是僅限于已知基因的檢測，同時讓多個基因的表達可視化有一定難度。如單分子RNA熒光原位雜交技術，使用熒光團標記的40個探針（每個探針由20個堿基組成），具有高靈敏度和亞細胞空間分辨率，但由于光譜重疊的局限性，只能靶向幾個基因。莊小威團隊開發的多重熒光原位雜交技術的靈敏度更高，彌補了單分子RNA熒光原位雜交技術通量低的缺陷，當前可在單細胞中同時完成1萬多個基因的表達定量，分辨率小于100納米，可在亞細胞水平定量轉錄本（即由一個基因轉錄形成的一種或多種可編碼蛋白質的成熟mRNA）。另外，一種用于檢測位于完整細胞中目標RNA的定量原位雜交技術——RNAscope，通過獨特的探針（雙Z探針）設計，可有效防止探針的非特異性結合，從而具有較強的特異性和靈敏度，針對無抗體或無法通過抗體檢測靶標的基因，可以使用RNAscope完成在組織水平或單個神經元中的基因表達定量定位研究。

（3）原位測序技術：基于掛鎖探針和熒光原位測序的兩種技術，借助酶進行擴增，但效率有待提高?？臻g解析轉錄子擴增子讀數映射（spatially resolved transcript amplication readout mapping， STARmap）是一種結合了水凝膠組織化學的原位測序技術，可實現亞細胞分辨率水平的基因表達定量，能同時檢測1000多個基因。

（4）原位捕獲技術：該技術顯著不同于常規轉錄組測序的地方是，用于捕獲細胞釋放的mRNA引物序列包含了代表空間坐標的條形碼。其基本步驟是：將組織切片貼到裝載這種特異引物序列的載玻片上，組織中釋放出的mRNA通過逆轉錄合成cDNA，再進行擴增、文庫構建和測序；同時比較原位雜交技術和原位測序技術對RNA分子進行的原位可視化結果。原位捕獲技術是先捕獲轉錄本，再進行非原位測序，可實現全轉錄本范圍內的RNA捕獲。這種特異引物序列的設計，是該技術成本昂貴的主要原因。

該方法在2016年發表的空間轉錄組技術中被首次提及。其技術要點是在載玻片上預置帶空間坐標條形碼的引物探針，每個探針區域的空間點（spot）直徑為100微米，后續該技術分辨率提高到55微米。此外，有團隊進一步提出Slide-seq技術，即先將帶空間坐標條形碼的RT引物探針附著在磁珠上，再將磁珠固定到載玻片上，以獲取所捕獲RNA的位置信息，分辨率達10微米，后續又進一步優化，大大提高了RNA捕獲效率，可達到普通單細胞轉錄組的檢測水平。后又有人使用更小的攜帶空間坐標條形碼的磁珠，分辨率達2微米。2022年，華大基因公司結合DNA納米球模式陣列和原位RNA捕獲技術，建立了Stereo-seq技術，相比較其他空間轉錄組測序技術，它支持更大的捕獲面積（芯片大?。?、更靈敏的基因捕獲能力和更高的細胞分辨率。

挑戰和前景

當前基于原位捕獲技術原理的空間轉錄組測序技術，使用范圍相對比較廣泛，可通過芯片捕獲RNA分子，同時標記其空間位置信息，但這類芯片的制作難度大、成本高，當前還無法大規模推行。高質量的空間轉錄組技術，需要同時實現高的單細胞分辨率、足夠的測序深度和基因捕獲量、普適不同大小的組織切片等功能。

空間轉錄組測序技術除在技術上有突破和加強外，在應對測序數據的分析上也發展出多種算法和工具[8]。

針對空間轉錄組數據的細胞分群和類型推斷方法，根據是否使用參考數據集，可分為兩種：一是整合單細胞轉錄組和空間轉錄組的數據，通過映射方式輔助完成細胞類型的空間定位，包括Spatial-ID、 Cell2location、Seurat、RCTD、Tangram等技術；二是整合空間轉錄數據提供的基因表達和空間位置或免疫組化的成像數據，通過無監督聚類和注釋的方式，識別細胞類型和類型特異的基因，包括SpaGCN、STAGATE、DestVI等方式。

在基于成像的空間轉錄組數據的細胞分割方面，主要有三大類方法：一是手動操作，基于細胞膜內外的熒光染色強度來識別細胞邊界，進行細胞分割，該方法工作量大，且結果易受質疑；二是監督圖像分割，這需借助一個手動注釋的數據集，再通過機器學習或深度學習的手段建立學習模型，完成細胞的分割；三是采用無監督方法，完全依賴熒光染色和轉錄信號完成對細胞的分割，如Baysor、SCS等技術。

技術的發展在生物醫學研究中是非常必要的。空間轉錄組技術的發展和應用，為認識大腦的細胞組成和分子特征奠定了基礎，為腦科學的研究帶來了更多的可能性。目前，結合空間轉錄組的多組學研究在生物醫學研究領域中的應用也越來越多，從而可以更加系統全面地解析細胞分子特征和疾病發生機制。

[1]Chen A， Liao S， Cheng M， et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell， 2022， 185： 1777-1792.

[2]Brodmann K. Vergleichenade Lokalisationslehre der Gro？hirnrinde. Leipzig： Johann Ambrosius Barth.1909.

[3]Badre D， Nee D E. Frontal cortex and the hierarchical control of behavior.Trends in Cognitive Sciences， 2018， 22（2）： 170-188.

[4]Agirman G， Broix L， Nguyen L. Cerebral cortex development： an outside-in perspective. FEBS Letters， 2017，591（24）： 3978-3992.

[5]Sousa A M M， Meyer K A， Santpere G， et al. Evolution of the human nervous system function， structure， and development. Cell，2017， 170： 226-247.

[6]Chen A， Sun Y， Lei Y， et al. Single-cell spatial transcriptome reveals cell-type organization in the macaque cortex. Cell，2023， 186（17）： 3726-3743.

[7]Asp M， Bergenstrahle J， Lundeberg， J. Spatially resolved transcriptomes-next generation tools for tissue exploration. Bioessays， 2020， 42（10）： e1900221.

[8]Park H E， Jo S H， Lee R H， et al. Spatial transcriptomics： technical aspects of recent developments and their applications in neuroscience and cancer research. Adv Sci， 2023， 10（16）： e2206939.

關鍵詞：大腦 新皮層 空間轉錄組測序技術 ■