乙醇C、O、H穩(wěn)定同位素在白酒摻偽鑒別中的潛在差異分析

楊華瑞，嚴(yán)虞虞，彭祖茂，李 意，陳偉杰，李明新，何詩慧，張協(xié)光

(1.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518131；2.國家營養(yǎng)食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（廣東），廣東深圳 218131；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院，貴州貴陽 550016)

白酒（Baijiu）是中國特有的一種蒸餾酒，與白蘭地(Brandy)、威士忌(Whisky)、伏特加(Vodka)、朗姆酒(Rum)和金酒(Gin)一起并稱為世界六大蒸餾酒。白酒是中國特色文化的象征之一，在中國數(shù)千年的歷史中有著舉足輕重的地位，古人借酒吟詩，流傳出了“蘭陵美酒郁金香，玉碗盛來琥珀光”“悲歡聚散一杯酒，南北東西萬里程”“金樽清酒斗十千，玉盤珍羞直萬錢”等諸多美好的詩詞，而現(xiàn)代人們的餐飲文化中，白酒也是不可或缺的一個(gè)。白酒具有以酯類為主體的復(fù)合香味，與生產(chǎn)原料、酒曲、發(fā)酵工藝等有關(guān)，按香型可分為濃香型、醬香型、清香型等多種，其中濃香型白酒是產(chǎn)量最大的類型，具有窖香濃郁、入口醇甜、爽凈、回味悠長的口感。

我國白酒消費(fèi)市場巨大，部分知名品牌白酒價(jià)格高企，一些不法商販在利益驅(qū)使下，利用低廉的工業(yè)酒精和食用酒精冒充品牌白酒進(jìn)行售賣。白酒假冒偽劣事件層出不窮，嚴(yán)重影響了白酒市場的健康發(fā)展，而造成假冒白酒現(xiàn)象嚴(yán)重的主要原因之一是白酒鑒別缺乏科學(xué)的檢測手段。白酒質(zhì)量評(píng)價(jià)主要依靠品酒師對(duì)酒的感官評(píng)價(jià)，缺乏客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及模型，主要是以酒的飲用和飲后口感對(duì)酒的品質(zhì)進(jìn)行初級(jí)判斷，導(dǎo)致消費(fèi)者無法準(zhǔn)確客觀的判斷酒的品質(zhì)和優(yōu)劣。白酒的科學(xué)指標(biāo)只有如總酸、總酯、高級(jí)醇、非酒精揮發(fā)物等少數(shù)幾種常規(guī)指標(biāo)，這些都不能有效的鑒別白酒的真?zhèn)?，造成了監(jiān)管無據(jù)可依的局面。

穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）技術(shù)可通過測試樣品中穩(wěn)定同位素比值分辨樣品的真?zhèn)?、產(chǎn)地等，是國內(nèi)外公認(rèn)最有效的鑒別手段之一[1-2]。國外研究團(tuán)隊(duì)采用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)建立了葡萄酒、白蘭地、朗姆酒等蒸餾酒的產(chǎn)地溯源和真?zhèn)舞b別方法[3-7]；國內(nèi)利用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)在白酒穩(wěn)定同位素比檢測、釀造過程中穩(wěn)定同位素變化、鑒別等方面也開展了諸多工作，如白酒中乙醇δ13C 值分析[8]、白酒中風(fēng)味物質(zhì)碳、氧穩(wěn)定同位素分析[9-10]、白酒釀造過程中乙醇碳穩(wěn)定同位素比值的變化[11]等。氣相色譜-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜（GC-IRMS）在分析醇、酯等低沸點(diǎn)物質(zhì)方面具有諸多優(yōu)勢，國內(nèi)外蒸餾酒的相關(guān)研究中以GC-IRMS 的運(yùn)用最為廣泛。GC-IRMS 可用來分析白酒的多種穩(wěn)定同位素比值，如白酒中乙醇或其他組分的δ13C、δ18O 和δ2H。國內(nèi)白酒摻偽鑒別大多圍繞白酒的碳穩(wěn)定同位素展開研究[12]，同時(shí)分析白酒中乙醇C、O、H 穩(wěn)定同位素比的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。本研究通過分析白酒、工業(yè)酒精、食用酒精中乙醇δ13C、δ18O 和δ2H 值的差異，考察乙醇C、O、H穩(wěn)定同位素在白酒摻偽鑒別中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

白酒樣品：由貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院提供，共21 個(gè)白酒品牌、28 批次白酒樣品。另外收集到7個(gè)工業(yè)酒精和5個(gè)食用酒精。

耗材及試劑：穩(wěn)定同位素比參考物質(zhì)為實(shí)驗(yàn)室自行校定的色譜純乙醇（δ13C=-31.744‰±0.006‰；δ18O=27.883 ‰ ±0.116 ‰ ；δ2H=-263.372 ‰ ±2.258‰），乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich）。

儀器設(shè)備：氣相色譜-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜聯(lián)用儀(Delta V Advantage)，美國Thermo Fisher；電子天平(XP6)，瑞士Mettler Toledo；智能酒精度檢測儀（STAW100），濟(jì)南盛泰電子科技有限公司；INNOWAX 氣相色譜柱（30 m×0.250 mm，0.25 μ m），美國Agilent。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

采用智能酒精度檢測儀對(duì)白酒樣品和酒精樣品進(jìn)行酒精度檢測，用乙腈稀釋至乙醇濃度約8 mg/mL，密封備用。

1.2.2 GC-IRMS條件

設(shè)置進(jìn)樣量1 μ L，進(jìn)樣口溫度200 ℃，載氣為高純氦。GC 升溫程序：起始溫度45 ℃，保留2 min，以20 ℃/min 速度升至180 ℃，保持2 min。測定δ13C 時(shí)，燃燒管梯度升溫至1030 ℃，參考?xì)膺x擇CO2；測定δ18O 時(shí)，氧裂解管梯度升溫至1280 ℃，參考?xì)膺x擇CO；測定δ2H 時(shí)，氫裂解管梯度升溫至1420 ℃，參考?xì)膺x擇H2。樣品在50 s 時(shí)切入，切入時(shí)長75 s，參考?xì)夥謩e在180 s、230 s 和280 s 時(shí)切入20 s。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

Isodat version 3.0 軟件用于同位素值的計(jì)算和數(shù)據(jù)獲取。試樣乙醇δ13C、δ18O 和δ2H 值采用實(shí)驗(yàn)室自行校定的色譜純乙醇進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

酒精以及白酒中的乙醇濃度較高，直接進(jìn)樣會(huì)造成信號(hào)過載，影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，也容易造成質(zhì)譜污染。為了確保檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和儀器精密度，通過改變稀釋比例、進(jìn)樣量和分流比等可將目標(biāo)峰的信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整至合理范圍。在稀釋過程中，稀釋溶劑選用純乙腈，一方面乙腈與酒精或白酒樣品可很好的互溶；另一方面乙腈中各元素不會(huì)與樣品中乙醇的C、O、H 發(fā)生置換影響乙醇的穩(wěn)定同位素比值。通過氣相色譜將乙醇和乙腈完全分離，可準(zhǔn)確檢測樣品中乙醇的δ13C、δ18O 和δ2H 值。本次收集的28 批次白酒的酒精度分布在38 %vol～52%vol范圍，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，用乙腈將樣品直接稀釋50倍，即可得到乙醇最終濃度約8 mg/mL 的稀釋樣液，以供GC-IRMS分析。然而質(zhì)譜的靈敏度較高，8 mg/mL 的乙醇濃度仍偏高，因此，在進(jìn)樣量選取時(shí)，選擇進(jìn)樣針的最小準(zhǔn)確進(jìn)樣體積1 μ L，再通過調(diào)節(jié)分流比進(jìn)一步調(diào)整目標(biāo)峰的響應(yīng)強(qiáng)度。分別設(shè)置分流比為5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、100∶1、200∶1和500∶1，對(duì)同一稀釋樣液分別檢測樣品CO2、CO、H2目標(biāo)峰，得到目標(biāo)峰的信號(hào)響應(yīng)結(jié)果如圖1 所示。根據(jù)IRMS 經(jīng)驗(yàn)，目標(biāo)峰的響應(yīng)度與參考?xì)夥宓捻憫?yīng)度相近時(shí)具有較好的準(zhǔn)確度，已知參考?xì)夥宓捻憫?yīng)度在3000～4000 mV，即樣品目標(biāo)峰信號(hào)強(qiáng)度在此范圍時(shí)對(duì)應(yīng)的分流比為最佳條件。因此，檢測δ13C 時(shí)分流比設(shè)置為50∶1；檢測δ2H 時(shí)分流比設(shè)置為25∶1；檢測δ18O 值時(shí)分流比設(shè)定為10∶1，以便得到更準(zhǔn)確的穩(wěn)定同位素比結(jié)果。

圖1 不同分流比時(shí)CO2、CO、H2目標(biāo)峰的響應(yīng)度

圖2 工業(yè)酒精、食用酒精和白酒的δ13C、δ18O、δ2H值分布

2.2 樣品測定結(jié)果

采用優(yōu)化后的GC-IRMS 方法分別對(duì)28 種白酒、7 種工業(yè)酒精和5 種食用酒精進(jìn)行檢測，得到各試樣乙醇δ13C、δ18O和δ2H值如表1所示。

表1 各試樣的酒精度和乙醇δ13C、δ18O、δ2H 值

40個(gè)試樣的乙醇δ13C值最大極差為0.21‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）均＜0.2‰，表明δ13C 測定結(jié)果穩(wěn)定性較好。生產(chǎn)白酒所用原料的δ13C 值與成品白酒乙醇δ13C 值之間存在相關(guān)關(guān)系，原料δ13C 值決定釀造后白酒乙醇δ13C 值的分布范圍[13]。在白酒的釀造中，主要以高粱、小麥為主，部分白酒為了保證獨(dú)特的香味，原料中還添加了大麥、玉米、豌豆、糯米等糧食作物，其中小麥、豌豆、糯米等是常見的C3 植物，δ13C 值多分布在-34 ‰～-20 ‰之間，而高粱、玉米等是典型的C4 植物，δ13C 值多分布在-17‰～-8 ‰之間[14]，以這些原料通過不同配比進(jìn)行釀造得到的白酒乙醇δ13C 值基本分布在-30‰～-10‰范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)28 種白酒樣乙醇δ13C 值分布在-25.576‰～-17.028‰之間，符合上述范圍，且與其他文獻(xiàn)[15-17]中報(bào)道的基本一致，說明測得的乙醇δ13C 值是合理的。食用酒精的乙醇δ13C 值分布范圍為-27.000‰～-17.876‰，與白酒乙醇δ13C值差異較小，可能是因?yàn)槭秤镁凭瑯右怨任铩⑹眍惖燃Z食作物為原料，與白酒釀造的原料之間δ13C差異不大，而原料的δ13C 值往往對(duì)成品δ13C 值起決定性作用，使得食用酒精乙醇δ13C 值與白酒乙醇δ13C 值之間差異不明顯。工業(yè)酒精δ13C 值與白酒乙醇δ13C 值之間存在顯著差異，可能與工業(yè)酒精的生產(chǎn)工藝有關(guān)，工業(yè)酒精主要由化工生產(chǎn)得到，原料來自于化工產(chǎn)品，原料與釀造酒精生產(chǎn)原料之間存在較大差異。鑒于白酒、食用酒精和工業(yè)酒精乙醇δ13C 值差異，說明碳穩(wěn)定同位素可運(yùn)用于鑒別白酒是否有摻假工業(yè)酒精；食用酒精與白酒樣乙醇δ13C 值差異較小，采用碳穩(wěn)定同位素鑒別白酒是否摻假食用酒精具有一定局限性。

40個(gè)樣品的乙醇δ18O值最大極差為0.26‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）均＜0.2‰，表明δ18O 測定結(jié)果穩(wěn)定性較好。從白酒、食用酒精到工業(yè)酒精的乙醇δ18O值依次呈現(xiàn)明顯的富集趨勢。白酒乙醇δ18O 值分布范圍較窄，28 種白酒樣的乙醇δ18O 值分布在-3.689 ‰～1.205 ‰之間，與食用酒精和工業(yè)酒精存在較大差異。工業(yè)酒精的乙醇δ18O 值最高，分布范圍為18.524 ‰～27.883 ‰，食用酒精的乙醇δ18O 值為9.241‰～16.787‰，介于工業(yè)酒精與白酒樣之間。白酒乙醇δ18O 值與工業(yè)酒精和食用酒精乙醇δ18O 值之間存在顯著差異，說明氧穩(wěn)定同位素在鑒別白酒摻假工業(yè)酒精和食用酒精方面具有較大的潛力，且對(duì)工業(yè)酒精摻假鑒別的能力優(yōu)于食用酒精摻假。

H 由于質(zhì)量輕，同位素分流效應(yīng)較大，δ2H 值穩(wěn)定性不如δ13C 和δ18O。40 個(gè)樣品經(jīng)過H3+校正后的乙醇δ2H 值最大極差為2.3 ‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）均＜2.5 ‰，小于儀器穩(wěn)定性要求的3 %[18]，δ2H 測定結(jié)果滿足要求。從δ2H 結(jié)果來看，白酒樣、食用酒精和工業(yè)酒精的乙醇δ2H 之間差異較小，相互之間存在較大范圍的交疊：白酒乙醇δ2H 值分布范圍為-257.264 ‰～-224.658 ‰；工業(yè)酒精乙醇δ2H 值分布范圍為-277.128‰～-244.021‰；食用酒精乙醇δ2H值分布范圍為-252.324‰～-233.680‰。三者乙醇δ2H 值差異較小，說明δ2H 值在鑒別白酒樣是否摻假食用酒精或工業(yè)酒精中存在較大困難。值得注意的是，在白酒的生產(chǎn)過程中，由于引入了大量的水，乙醇的羥基H/D由于解離與水解離的H/D 發(fā)生置換反應(yīng)，會(huì)影響到原始乙醇的δ2H 值，使得乙醇δ2H 值與生產(chǎn)原料的δ2H 值之間存在一定差異，不利于乙醇的生產(chǎn)溯源和摻偽鑒別。

3 結(jié)論

本研究采用GC-IRMS 同時(shí)對(duì)白酒、食用酒精和工業(yè)酒精中乙醇δ13C、δ18O、δ2H 值進(jìn)行了檢測分析和數(shù)據(jù)比對(duì)，根據(jù)C、H、O 3 種穩(wěn)定同位素比的差異發(fā)現(xiàn)：氧穩(wěn)定同位素在鑒別白酒摻假食用酒精和工業(yè)酒精方面具有較大的潛力；碳穩(wěn)定同位素可運(yùn)用于鑒別白酒是否有摻假工業(yè)酒精，但在食用酒精摻假方面具有一定局限性；氫穩(wěn)定同位素由于差異性小，穩(wěn)定性不如碳、氧穩(wěn)定同位素，受水中H/D影響等多重因素，在鑒別方面存在一定困難。根據(jù)鐘其頂?shù)萚19-20]的研究，將樣品中乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸鈣，原乙醇的羥基H/D 由于被氧化去掉，乙醇甲基H/D被保留在乙酸鈣中，通過測乙酸鈣的δ2H 值得到乙醇的甲基位的氫穩(wěn)定同位素比，該方法能有效避免水影響乙醇δ2H，便于通過氫穩(wěn)定同位素研究釀造乙醇與原料的關(guān)系，在溯源和摻假方面具有重要的研究意義。