基于毒理基因組學的工業廢氣顆粒物毒性分析方法及應用

何 劍，吳興剛，王珊珊，鄭 興，劉玉玲

西安理工大學市政與環境工程系，陜西 西安 710048

目前，顆粒物的毒理研究主要采用細胞體外暴露和動物暴露實驗的方法[1].在細胞體外暴露實驗中，顆粒物會與細胞直接接觸并引起細胞毒性反應，通過分析細胞毒性的變化和差異，可以評估顆粒物的毒性和毒理機制[2-4].華秋翰等[5-6]采用人支氣管上皮細胞進行顆粒物染毒，對細胞的氧化損傷效應、細胞凋亡和DNA 損傷數據進行相關性分析.Saint-Georges等[7]將支氣管中分離出的人肺泡巨噬細胞暴露于敦克爾市的PM2.5中，旨在提高對大氣顆粒物誘導細胞毒性的作用機制的認識.然而，細胞體外暴露實驗涉及到昂貴的培養基、試劑以及細胞培養器具的采購和維護，增加了實驗的經濟成本，由于細胞培養和處理的復雜性，這種方法需要較長的周期來進行實驗操作和結果分析，限制了實驗的效率和及時性[8].動物暴露實驗則更直接模擬了人體暴露于環境污染顆粒物的情況，觀察其對動物的影響，評估顆粒物的毒性和毒理機制，從而更好地指導環境保護和健康預防工作[9].Ying 等[10]應用空氣富集濃縮系統對實驗小鼠染毒，研究大氣顆粒物在濃縮環境的心血管毒性.Chen等[11]將小鼠暴露于高污染PM2.5環境中進行自主呼吸染毒實驗，研究環境顆粒物對敲除載脂蛋白E 的小鼠動脈硬化的影響.然而，這種方法涉及到動物的飼養、繁殖和實驗操作等方面的成本，以及實驗操作所需的耗材和設備.此外，動物實驗需要經過倫理審查，增加了實驗的復雜性和周期[12].

近年來，隨著分子生物學、基因組學等技術的發展，基于毒理基因組學的方法也開始嘗試應用于顆粒物毒理研究中，通過對基因表達等方面的分析，進一步揭示顆粒物的毒理機制和作用途徑[13-17].但毒理基因組學法如微陣列、蛋白組學、代謝組學等[18-19]仍具有消耗資源、操作復雜以及成本較高的缺點，缺乏標準的結果解釋方法與即時性.為了解決這些問題，Gou 等[20]開發了一種利用GFP (Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白)重組大腸桿菌的細胞陣列毒性評估方法，提出使用TELI 值(Transcriptional Effect Level Index，轉錄效應水平指數)來量化化學物質誘導的基因表達水平變化，并通過TELI 劑量-反應曲線推導出相關的毒性終點，可同時檢測多種應激反應途徑，具有快速、準確、靈敏等優點[21].由于該方法涉及到多個學科領域，對于實驗設計、樣本選擇、數據分析等都需要制定相應的標準化流程，且缺乏合適的預處理方法，導致顆粒物的整體毒理分析受到限制[22].

為了能準確高效地測定工業廢氣顆粒物的毒性，本研究采用毒理基因組學的毒性測試方法，通過大量探索性實驗，提出了新的預處理手段來解決該方法在工業廢氣顆粒物測試中的應用障礙，分析驗證該方法對工業廢氣顆粒物毒性檢測的可行性，并應用于鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內顆粒物的毒性分析，得到了廢氣顆粒物毒性變化規律和毒性大小，提出了毒理基因組學方法應用在工業廢氣顆粒物毒性分析的工作流程，以期為工業廢氣顆粒物的深度治理和毒性檢測提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗涉及的六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)、無水氯化鈣(CaCl2)、硫酸卡那霉素(C18H38N4O15S)和M9低鹽培養基(Gibco? M9)分別購自廣東省化學試劑工程技術研究開發中心、天津市申泰化學試劑有限公司、北京諾博萊德科技有限公司和上海瑞楚生物科技有限公司，LB 肉湯(Lennox)、葡萄糖(C6H12O6)、硝酸(HNO3)、過氧化氫(30%H2O2)、丙醇(C3H8O)、甲醇(CH3OH)均購自國藥集團化學試劑有限公司.主要儀器涉及電熱恒溫培養箱(WP25AB 型，天津泰斯特儀器有限公司)、全自動移液工作站(epMotion 5075 t 型，艾本德股份公司，德國)、立式壓力滅菌鍋(LDZX50KBS 型，上海申安醫療器械廠)、酶標儀(Cytation5 型，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心)、紫外燈箱(LX-2130 型，西安曼哲機械設備有限公司)、超聲清洗儀(Jipad22-500 型，上海旌派儀器有限公司).

1.2 實驗菌株

實驗菌株為GFP 轉染的包含有110 種不同啟動子的大腸桿菌，這些啟動子控制大腸桿菌K12、MG1655 中最常見的應激反應和其他特定生理功能相關的基因表達.每個啟動子融合都由低拷貝質粒pUA66 或pUA139 表達，該質粒包含一個卡那霉素抗性基因和一個快速折疊的gfpmut2基因，能夠以高精度和可重復性測量基因表達[23]，所有應激基因的相關功能可在www.ecocyc.com 查詢.

1.3 工業廢氣顆粒物的采集及預處理

1.3.1 工業廢氣顆粒物的采集

根據鋼鐵廠廢氣顆粒物的排放特點，采集焦化工序的焦爐尾氣及煙塵，樣品來自寶山鋼鐵股份有限公司；鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內不同電場顆粒物樣品采自新疆昆玉鋼廠.

1.3.2 工業廢氣顆粒物有機組分提取

取10 mg 的工業廢氣顆粒物樣品，加入裝有10 mL 甲醇與丙醇體積比為1∶1 的離心管中，超聲振蕩30 min[24]，氮吹至近干，加入10 mL 超純水，并超聲30 min，0.45 μm 微孔的濾膜過濾，得到工業廢氣顆粒物有機組分染毒液，把濾液裝入15 mL 無菌尖底離心管中保存.以此為原樣，將原樣用超純水以10倍等梯度稀釋為6 個梯度濃度.

1.3.3 工業廢氣顆粒物無機組分提取

取10 mg 工業廢氣顆粒物樣品研磨至粒徑在10 μm 及以下，將研磨后的顆粒物樣品加入裝有10 mL 超純水的燒杯中混合均勻，超聲振蕩30 min，通過0.45 μm 濾膜過濾后將濾液置于常溫儲存；將濾渣放入烘箱烘干，二次研磨，并將研磨后的顆粒物加入裝有5 mL 30%HNO3溶液的燒杯中，超聲振蕩30 min，加入5 mL 的30%H2O2溶液，超聲振蕩1 h；95 ℃高溫振蕩至無明顯液體時，加入10 mL 上述儲存濾液，振蕩1 h，再通過0.45 μm 濾膜過濾，得到顆粒物無機組分染毒液.

1.4 工業廢氣顆粒物毒性測試方法

毒性測試過程中，受試生物對于樣品暴露下的耐受濃度是有一定限制的，需要滿足受試生物的細胞存活率高于95%才可以進行測試[21].工業廢氣顆粒物預處理后，將初始濃度為10 mg/mL 的樣品用超純水以10 倍等梯度稀釋為6 個梯度，分別稀釋至1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 mg/mL；之后進行細胞存活率(最大耐受濃度)實驗，得到大腸桿菌最大耐受濃度(EC5)，然后以EC5為實驗濃度上限依次向下稀釋10 倍進行實驗.毒性測試儀器為酶標儀，具體實驗過程：將大腸桿菌菌株置于96 孔板中，在37 ℃條件下靜置過夜培養；將培養好的大腸桿菌使用的1×M9 培養基按1∶5 稀釋，轉接至384 孔板；將384 孔板中的菌液在37 ℃下培養5～6 h，使其光密度OD600達到早期指數生長階段(約為0.2)；培養后的384 孔板中添加不同濃度的顆粒物溶液；為了測定顆粒物誘導的基因轉錄水平效應，將384 孔板置于微孔板成像儀中，同時測OD600和熒光讀數GFP 水平(激發波長為45 nm，發射波長為528 nm)，以2 h 為暴露時間，每5 min 測定一次讀數，實驗設置3 組平行樣.實驗過程如圖1 所示.

圖1 實驗流程示意Fig.1 Flow chart of toxicological genomics experiment

1.5 TELI 值計算

將顆粒物暴露導致的特定基因在每個時間點基因表達的改變稱為誘導因子I.I=Pe/Pc，Pe 和Pc 分別表示基因在化學樣品暴露條件和對照(無化學樣品暴露)條件下的表達水平[25].若I?1，表明對該基因起正向調控作用；若I<1，表明對該基因起負向調控作用.利用各時間點I的自然對數(lnI)進一步分析，確定并分析特定應激反應通路有關的遺傳變異，從而揭示毒理機制.通過確定單個基因的TELI 值(TELIgene)，或代表特定途徑(TELIpathway)、氧化應激(TELIoxidative)、DNA 應激(TELIDNA)、膜應激(TELImembrane)、蛋白應激(TELIprotein)和普遍應激(TELIgeneral)以及整體基因(TELItotal)的TELI 值，可以對顆粒物的毒性進行評價.特定基因在2 h 暴露時間內的累計轉錄效應的TELI計算公式：

式中：i為測定庫中基因的數量；t為暴露時間，h.

在顆粒物暴露條件下，反應大腸桿菌細胞總體轉錄水平的TELI 值，即TELI(total)，計算公式：

式中，W為總應激反應中每類應激反應的權重因子，定義其值為1.此外，使用TELI 值量化物質誘導的基因表達水平變化值，當TELI≥1.5 時，應激反應轉為毒性效應[23].

1.6 毒理分析方法

為了評估工業廢氣顆粒物誘導大腸桿菌細胞基因表達或應激反應的強弱，以TELIpathway數據為基礎制作紅黑熱圖.在鋼鐵廠不同焦化工序和不同顆粒物樣品濃度條件下，通過顆粒物紅黑熱圖的顏色確定應激反應類別.采用四參數非線性回歸模型(4PL)擬合分析以TELItotal數據為基礎的濃度-響應曲線，得到焦化工序廢氣顆粒物的受試濃度范圍及毒性終點，并且通過工業廢氣顆粒物的毒性作用模式和作用機制的相似度使毒性物質的分類更加精確.

2 方法驗證

2.1 實驗細胞存活率測試

對某鋼鐵廠焦化工序(干熄焦、導焦、推焦)廢氣顆粒物進行預處理，然后進行細胞存活率實驗.由圖2可見，焦化工序廢氣顆粒物樣品在高濃度時對細胞生長表現出抑制作用，通過稀釋顆粒物樣品大腸桿菌細胞存活率均可達95%，隨著各樣品溶液稀釋倍數的增加，OD600值增高，大腸桿菌細胞活性增強.大腸桿菌細胞在干熄焦、導焦、推焦有機組分暴露的最大耐受濃度分別為10、0.01、0.1 mg/mL，無機組分暴露的最大耐受濃度分別為1、0.1、0.1 mg/mL.

圖2 鋼鐵廠焦化工序廢氣顆粒物樣品濃度對細胞生長的抑制情況Fig.2 Inhibition of cell growth by sample concentration of exhaust particulate matter in coking process of iron and steel plant

2.2 驗證實驗結果分析

以TELIpathway數據為基礎作焦化工序廢氣顆粒物誘導大腸桿菌基因表達的紅黑熱圖，結果如圖3所示.由圖3 可見，焦化工序廢氣顆粒物有機組分誘導大腸桿菌產生的共同應激模式為氧化應激.研究[26-27]表明，顆粒物中有機組分多環芳烴(PAH)在酶的作用下可轉化為醌類，從而產生氧化應激效應，表現為細胞內氧化損傷的程度明顯增加.此外，筆者研究發現，干熄焦和導焦顆粒物有機組分可誘導細胞產生較為明顯的蛋白應激.推焦和導焦顆粒物無機組分誘導細胞的應激模式分別為DNA 應激和膜應激，與已有研究所得結論[28-29]吻合.產生DNA應激反應是因為金屬元素芬頓(fenton)反應產生活性氧，刺激內質網應激效應，從而導致DNA 鏈發生斷裂，而細胞發生膜應激是由于顆粒物表面氧化自由基過多，產生脂質過氧化氫反應，從而影響細胞膜結構改變.因此，將毒理基因組學毒性測試方法應用于工業廢氣顆粒物的毒性測試中，得到的應激反應模式與現有研究結論[30]一致.同時還發現，焦化工序廢氣顆粒物有機組分誘導細胞表現出潛在的蛋白應激模式，說明毒理基因組學的毒性測試方法不僅具有準確性，還能更加全面地闡述潛在的毒性模式.

圖3 鋼鐵廠焦化工序廢氣顆粒物有機組分和無機組分的毒性作用模式Fig.3 Toxicity mode diagram of organic and inorganic components of particulate matter in coking process of iron and steel plant

3 基于毒理基因組學的工業廢氣顆粒物毒性分析方法應用

為研究鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內顆粒物毒性的變化規律，采集某鋼鐵廠燒結機頭電除塵器1 號～4 號電場下灰斗卸灰樣品，4 個電場按從前到后排列，前后電場中顆粒物的粒徑和密度存在差異.按1.4 節方法進行大腸桿菌的存活率(最大耐受濃度)實驗，結果如圖4 所示.

圖4 電除塵器內各電場顆粒物樣品濃度對細胞生長的抑制情況Fig.4 The concentration of particulate matter samples in each electric field in the electrostatic precipitator inhibits cell growth

由圖4 可見，在電除塵器4 個電場(1 號、2 號、3 號、4 號)中大腸桿菌對顆粒物有機組分暴露的最大耐受濃度分別為1、10、1 和0.1 mg/mL，對顆粒物無機組分暴露的最大耐受濃度分別為0.1、0.1、0.1和0.01 mg/mL.

3.1 基于毒理基因組學的毒性作用模式分析

通過鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內各電場顆粒物作用模式(見圖5)發現，暴露于4 個電場的顆粒物有機組分后，大腸桿菌均表現出氧化應激反應，與已有研究結果[31]一致.其中，在1 號電場顆粒物的有機組分暴露中還表現出較為明顯的普遍應激，而普遍應激的已知功能是細胞生物化學和物理穩態的干擾，推測是因電場顆粒物的有機組分對重組大腸桿菌的生物化學穩態造成干擾，進而導致普遍應激損傷.暴露于4 個電場的顆粒物無機組分后，大腸桿菌卻表現出不同的毒性作用模式，1 號電場顆粒物引起的普遍應激反應最強烈，2 號電場顆粒物引起的DNA 應激較為明顯，3 號電場顆粒物引起的氧化應激和蛋白應激模式較為明顯，4 號電場顆粒物則誘導大腸桿菌表現出較為強烈的蛋白應激.通過毒性作用模式圖能夠快速揭示工業廢氣顆粒物的毒性作用途徑.

圖5 電除塵器各電場顆粒物毒性作用模式圖Fig.5 Toxicity mode diagram of particles in each electric field of electrostatic precipitator

3.2 工業廢氣顆粒物毒性作用機制研究

將大腸桿菌暴露于電除塵器內各電場不同顆粒物濃度下有機組分和無機組分中，對5 大類應激反應的結果進行匯總分析，得到各類應激TELI 值(TELIoxidative、TELIprotein、TELImembrane、TELIgeneral、TELIDNA)，結果如圖6 和圖7 所示.

圖6 電除塵器各電場不同顆粒物濃度下有機組分誘導細胞的應激反應變化情況Fig.6 The stress response histogram of cells induced by organic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator at different concentrations

圖7 電除塵器內各電場不同顆粒物濃度下無機組分誘導細胞的應激反應變化情況Fig.7 The stress response histogram of the cells induced by the inorganic components of the electric field particles in the electrostatic precipitator at different concentrations

由圖6 和圖7 可見，鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內各電場顆粒物有機組分和無機組分誘導細胞產生了不同應激表達水平.對于電除塵器內顆粒物有機組分而言，1 號電場顆粒物有機組分主要誘導細胞產生的應激模式為膜應激、氧化應激和普遍應激；2 號電場顆粒物有機組分主要誘導細胞產生氧化應激和膜應激，特別在顆粒物有機組分濃度最高時，出現了強烈的普遍應激反應；3 號電場顆粒物有機組分主要誘導細胞產生蛋白應激和膜應激；4 號電場顆粒物有機組分主要誘導細胞產生氧化應激和DNA 應激.對于電除塵器內顆粒物無機組分，1 號電場顆粒物無機組分主要誘導細胞產生的應激模式為普遍應激和DNA應激；2 號電場顆粒物無機組分主要誘導細胞產生DNA 應激和普遍應激；3 號電場顆粒物無機組分主要誘導細胞產生氧化應激和蛋白應激；4 號電場顆粒物無機組分主要誘導細胞產生的應激模式為膜應激和蛋白應激，且在顆粒物無機組分濃度最高時，普遍應激反應強烈.各電場顆粒物誘導細胞應激模式的差異與自身沉降變化有關，1～4 號電場顆粒物采集按照從前到后的順序，受重力作用后方電場顆粒物的粒徑和密度變小，導致4 個電場顆粒物成分存在差異；同時，顆粒物有機組分和無機組分濃度的變化也會引起應激模式改變，主要原因是隨著濃度的增加，顆粒物之間會發生碰撞、聚集和堵塞現象，這些相互作用會影響顆粒物的運動和沉積方式，導致應激模式的改變.通過分析電除塵器內各電場顆粒物的應激模式，能夠準確揭示工業廢氣顆粒物毒性作用機制，對于理解不同電場顆粒物的毒性機制以及制定相應的治理措施具有重要意義，更好地實現工業廢氣的凈化和環境保護.

3.3 電除塵器內顆粒物毒性終點推導

采用四參數非線性回歸模型(4PL)擬合分析以TELItotal數據為基礎的濃度-響應曲線(見圖8).當應激程度足夠高時，會對細胞導致不可逆損傷，可能會存在一個閾值，并且超過該閾值應激便轉為損傷并最終發展成可觀察的表型毒性，定義最大效應指標(TELImax)為該閾值.毒性終點EC-TELI1.5，即應激反應轉化為毒性效應的臨界暴露濃度.傳統毒性終點半數致死濃度EC50(導致50%機體發生不利反應的濃度)以及2 種分子毒性終點數據如表1 所示.

表1 電除塵器內各電場顆粒物有機組分和無機組分毒性終點指標Table 1 Toxicity endpoint indexes of organic and inorganic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator

圖8 電除塵器各電場內顆粒物有機組分和無機組分的濃度-響應曲線Fig.8 Concentration -response curves of organic and inorganic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator

由圖8 和表1 可見，4 號電場顆粒物有機組分誘導細胞的應激表達最為迅速、靈敏，且毒性終點最小，為3.01×10-10mg/mL.在4 個電場顆粒物的有機組分中，2 號電場的TELImax值(3.161)最大，4 號電場的TELImax值(2.134)最小，與EC50結果一致，也說明4 號電場顆粒物有機組分是最可能誘導細胞出現表型損傷的.對于4 個電場顆粒物無機組分而言，4 號電場顆粒物的EC50最小，為4.47×10-4mg/mL；同時，4 號電場顆粒物無機組分誘導細胞的應激表達最為迅速，毒性終點最小，為8.44×10-6mg/mL，表明4 號電場顆粒物無機組分是最可能誘導細胞出現表型損傷的.綜上，本研究中鋼鐵廠燒結機頭電除塵器內各電場顆粒物有機組分毒性呈4 號電場?3 號電場? 1 號電場?2 號電場的特征，顆粒物無機組分的毒性呈4 號電場?2 號電場?1 號電場?3 號電場的特征.電除塵器內各電場顆粒物的毒性差異主要是由于顆粒物在電除塵器中的分離和沉降過程導致不同電場中顆粒物成分可能有所差異所致.4 號電場為該電除塵器末電場，該處顆粒物代表電除塵器末端逃逸顆粒物的特性，大多輕細，其毒性最大表明對工業點源開展微細顆粒物深度治理的必要性.同時，按此方法可以快速、準確地將工業廢氣顆粒物的毒性按照大小排序，對深入推進工業廢氣顆粒物超低排放改造工作有實際意義.

4 結論

a)鑒于工業廢氣排放問題日益嚴峻，顆粒物毒性分析對維護環境和保障健康至關重要.為此，提出了工業廢氣顆粒物有機物和無機物的毒性分析預處理方法，消除了毒理基因組學方法應用于整體顆粒物毒性分析的主要障礙，基于酶標儀開展毒性測試，并利用基因熱圖分析、應激模式反應和毒性終點確定顆粒物的毒性作用機制，得到了一種能完成工業廢氣顆粒物整體毒性分析的方法，相較于傳統毒理實驗，該方法準確高效，且能更全面地闡述顆粒物毒性模式.

b)將毒理基因組學的方法應用于某燒結機頭電除塵器內顆粒物的毒性變化規律分析，得到各電場受試顆粒物有機組分和無機組分毒性作用機制、分子毒性終點及毒性大小，并從毒理學角度說明了開展微細顆粒物污染深度治理、工業煙氣超低排放改造工作的重要性.