鐵碳強化潮汐流-潛流復合人工濕地處理模擬養殖尾水的啟動運行效果

張 美，王家宏，白 楊

陜西科技大學環境科學與工程學院，陜西 西安 710021

近幾年來，養殖業中使用的抗生素類藥物和飼料的比重越來越高[1-2].抗生素不能被動物完全吸收，會隨著動物的糞便排出體外，造成一定的環境污染問題[3]，還會增加細菌耐藥性和抗生素耐藥性基因的能力[4]，加大混合廢水的處理難度[5]，進一步對人類生存環境以及身體健康帶來危害[6-7].其中，四環素是養殖業中使用最普遍的一種抗生素，其廢水的排放對環境造成了嚴重影響.Hong 等[8]對中國西北河西走廊108 個畜牧飼養廠36 種不同環境介質的有關抗生素成分進行檢測評估，發現四環素大類中金霉素含量最高，達105 ng/g；陳小桐等[9]通過對遼寧省家畜禽養殖業中抗生素的排放進行分析，發現磺胺類和四環素類抗生素年排放總量達280 t；Wang 等[10]對東南地區畜牧養殖獸用抗生素進行風險評估，結果表明需重點關注四環素、土霉素等抗生素對環境造成的生態風險；吳永明等[11]在對江西某養豬場抗生素的研究中發現，四環素類抗生素在豬飼料和糞污中含量最高.當這些養殖尾水釋放到環境中，會導致水生生物難以生存繁殖.國家正在大力發展養殖業，因此，開發一種經濟、環保、高效的養殖尾水處理技術具有重要作用.

人工濕地是通過模擬天然濕地系統由人工搭建和管理的一種可持續發展的生態技術[12]，它具有高效、經濟、去污效率高且管理方便等特點[13].卿葉[14]在研究養殖尾水中抗生素對人工濕地反硝化作用機理研究中表明，當四環素濃度≥100 μg/L 時可以降低水環境中各種形態氮的轉化速率，尤其當濃度為2 mg/L時可徹底抑制水體中氮的轉化過程.Chen 等[15]研究表明，0.2 mg/L 的四環素幾乎不會對脫氮除磷效果造成不利影響，但在一定程度上抑制了反硝化的進行，阻礙了氮的去除.由于人工濕地類型及填料的選擇和布料方式的不同[16]，其氮磷的去除效果也不盡相同[17]，因此近年來復合型人工濕地系統已經逐漸發展起來，并被廣泛推廣應用[18-20].污水在潛流式人工濕地系統中能與植物根系充分接觸[21]，又能利用填料表面的微生物進行降解去除.潮汐流人工濕地是一種好氧-厭氧循環的生態系統，不僅能增加系統的富氧量，還可以增加污染物的去除效率.如Austin 等[22]在研究過程中發現，在處理同樣體積的污水時，潮汐流人工濕地比曝氣人工濕地對污染物的處理效果更好，同時消耗的能量更少，且占地面積也減半；Khajah 等[23]在潮汐流人工濕地脫氮性能研究中發現，該人工濕地系統可以最大限度地減少外部碳源的輸入；Zheng 等[24]研究表明，潮汐流人工濕地能明顯改善水體中的富氧情況，并使水體中污染物的去除效率得到明顯的提升.鐵碳填料具有高效、成本低、操作簡單且可以強化系統的脫氮除磷功能等特點[25-26]，被廣泛應用于強化工藝系統的脫氮除磷.如Liao 等[27]的研究表明，Fe-C基質和松樹皮可以作為增強垂直上升流人工濕地對再生水中氮和磷的替代基質，Fe-C 基質的加入顯著改變了微生物群落，增強了反硝化作用；Wei 等[28]在人工濕地系統中利用鐵碳微電解提高了凈化污染物和去除重金屬的能力，結果顯示，TN 的去除率為89.04%，鉻的去除率為98.96%，鉛的去除率為97.09%；Dai 等[29]利用鐵碳填料構建了濕地微生物燃料電池處理廢水中環丙沙星污染物，發現該系統對于磷酸鹽和環丙沙星的去除效率有明顯的提高.

因此，本研究采用實驗室自制的鋁基陶粒(PCW)填料構建潮汐流-潛流復合人工濕地系統，并在二級潛流系統中添加適量的鐵碳填料與自制陶粒(CCW)結合，以此來實現鐵碳微電解工藝與潛流式人工濕地系統的聯用.在此條件下，探究四環素和鐵碳填料在啟動期對濕地系統內各污染物去除情況的影響以及微生物群落結構和物質組成的變化，以期為人工濕地處理含抗生素廢水的研究提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 潮汐流-潛流復合人工濕地的構建

如圖1 所示，在實驗室內搭建兩組模擬潮汐流-潛流組合人工濕地系統(高1 130 mm，內徑130 mm，外徑160 mm)，設置四環素實驗組(TC 組)和對照組兩組系統，其進水水質略有不同(詳見1.2 節).一級系統和二級PCW 系統裝置從上到下分別填充粒徑為6～9 mm、3～6 mm、9～12 mm 的實驗室自制陶粒[30]，二級CCW 系統的2 號和3 號取樣點間分別填充兩層高12 cm 的新型鐵碳微電解填料(購自平頂山市綠之原活性炭有限公司)，其余與一級系統和二級PCW 系統填充方式相同.每個系統裝置底部均鋪設直徑為2～3 cm 的鵝卵石作為支撐層，沿程設置4 個取樣點.

圖1 潮汐流-潛流復合人工濕地系統裝置Fig.1 The tidal flow-subsurface flow composite constructed wetland test equipment

1.2 試驗設計和進水水質

本研究所使用的接種污泥是從某污水處理廠二沉池中提取，將稀釋后的活性污泥加入各裝置中進行掛膜和啟動，進行3 d 微生物培養，每天更換營養液.一級系統采用的是間歇進水/瞬時排水的潮汐流模式，淹沒時間為12 h，空置時間為12 h；二級系統采用的是間歇進水模式，淹沒時間為24 h.實驗啟動時間為春季，啟動期間室溫溫度為18～22 ℃.

進水依據畜禽養殖尾水水質在實驗室進行人工配制，水中碳源、氮源和磷源分別由CH3COONa、NH4Cl 和KH2PO4模擬配置而成，COD、NH4+-N 和TP的濃度分別為300、60 和5 mg/L.TC 組加入0.2 mg/L的鹽酸四環素溶液.

1.3 常規水質分析方法

每天采用棕色玻璃瓶在同一時間、同一取樣口進行取樣，水樣于4 ℃冰箱中低溫儲存.水質指標的分析方法[31]如下：TP 濃度采用鉬酸銨分光光度法測定；CODCr濃度采用快速消解分光光度法測定；NH4+-N濃度采用納式試劑分光光度法測定；NO3--N 和NO2--N濃度采用紫外分光光度法測定；TN 濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定.

1.4 微生物測定方法

選用脂磷法作為濕地生物量的測定方法，具體參照于鑫等[32]的操作步驟.應用高通量測序技術研究兩組濕地系統不同處理單元在啟動期時脫氮除磷微生物群落結構和物種組成的變化情況.

2 結果與討論

2.1 啟動期各污染物去除效果

2.1.1 CODCr的去除效果

CODCr進出水濃度和去除率如圖2 所示.由圖2可見，啟動前期CODCr的出水濃度有較大的波動，隨著時間的推移系統逐漸穩定，CODCr的去除率逐漸增加且相對穩定.人工濕地系統中，CODCr的去除主要是通過微生物的吸收利用、填料的吸附過濾和植物根系的截留作用，TC 組和對照組中一級系統啟動后期CODCr去除率范圍為72.58%～84.59%，二級CCW系統和二級PCW 系統在啟動期去除率范圍最終均為91.41%～92.84%.

圖2 濕地系統啟動期CODCr 的去除效果Fig.2 The removal effect of CODCr in the start-up period of wetland system

從圖2 還可以看出，四環素的存在降低了一級系統對CODCr的去除率，二級系統中CODCr的去除沒有發生明顯的變化.廢水中CODCr大部分在一級系統中得到去除，一級系統潮汐流方式具有較強的富氧能力，可以為系統中微生物提供更多的氧，從而促進有機物的去除，并且一級系統采用的自制陶粒表面粗糙、內部孔隙發達，利于微生物的生長，進一步促進CODCr的去除.因此，四環素的加入在一級系統中存在明顯抑制作用，廢水進入二級系統中CODCr濃度較低，抑制作用較低.

TC 組和對照組在二級CCW 系統中的CODCr平均出水濃度(分別為36.32、39.84 mg/L)都比二級PCW系統(分別為55.09、52.14 mg/L)低.添加鐵碳填料在人工濕地中進行原電池反應，將大分子有機物降解為微分子有機物[33]，促進微生物的生物降解，改善廢水的生化性，強化CODCr的去除效果.

2.1.2 TP 的去除效果

從圖3 可以看出，隨著時間的推移，啟動期TP 的進出水濃度以及去除率均保持著相對穩定的狀態.一級、二級系統去除率均較高，其中一級去除率為87.14%～88.64%，二級去除率為93.57%～96.04%.人工濕地中TP 主要通過填料對磷的吸附[34]、植物根莖的吸收和聚磷菌吸磷等方式去除[35]，因啟動期生物膜還處于不斷生長的狀態，故磷的去除主要靠填料的吸附截留.

圖3 濕地系統啟動期TP 的去除效果Fig.3 The removal effect of TP during the start-up period of wetland system

相比于對照組，TC 組一級系統和二級系統TP去除率分別降低1.5%、2.7%.這表明四環素的加入具有一定的刺激性，使填料吸收磷的能力降低，從而降低磷的去除效率[36].二級CCW 系統的處理效果優于二級PCW 系統，較二級PCW 系統的處理效果提高了0.73%～2.47%，可能是由于人工濕地系統中添加了鐵碳填料，其對磷發揮協同效應，PO43-易與鐵碳填料中的Fe3+、Fe2+生成磷酸鹽沉淀從而將磷去除[25].此外，水解鐵產生的含水Fe3+和Fe2+還可以吸附磷酸鹽形成含水氧化鐵-磷酸鐵絡合物[25].因此，添加鐵碳填料可以強化人工濕地系統對磷的去除.

2.1.3 氮的去除效果

經系統處理后NH4+-N 和TN(見圖4)的出水濃度顯著降低，一級系統可以去除大部分的NH4+-N 和TN，NH4+-N 經二級系統凈化后基本可以完全去除，兩級系統對NH4+-N 和TN 的去除率分別為98%和88%.

圖4 濕地系統啟動期NH4+-N 和TN 的去除效果Fig.4 The removal efficiency of NH4+-N and TN during the start-up period of wetland system

對比TC 組和對照組發現，四環素對NH4+-N 的去除有明顯的抑制作用，一級系統NH4+-N 去除率平均下降9.57%.與二級CCW 系統相比，二級PCW 系統NH4+-N 及TN 的去除更易受四環素的影響.但四環素對系統中NO3--N 和NO2--N 的積累影響不大，其在體系中的殘留濃度可以作為去除NO3--N 和NO2--N 的補充碳源.同時發現，二級CCW 系統對NH4+-N 的處理效果以及啟動后期對TN 的處理效果均優于二級PCW 系統，其中TN 的影響更為明顯，TC 組和對照組中二級CCW 系統TN 去除率比二級PCW 系統分別高出5.77%和3.84%，這與趙仲婧等[37]研究結果一致.這是由于Fe 的加入增加了氨單加氧酶和亞硝酸鹽氧化還原酶的量[38]，這兩種酶的存在有利于NH4+-N 的硝化[39].另外碳的存在可以提高對NH4+-N 的吸附能力，也可以為微生物提供營養物質，提高微生物的豐富度[40]，有利于NH4+-N 的去除.鐵碳微電解的形成可以為系統提供[H]和Fe2+供反硝化過程利用[41]，從而提高TN 的去除率.與二級PCW 系統相比，二級CCW 系統中NO3--N 和NO2--N 的積累量(見圖5)較低，說明鐵碳系統可以利用微小原電池電極的腐蝕為其提供大量的電子.鐵碳填料在轉換反應中會產生Fe2+和Fe3+，這兩種物質易與四環素發生絡合，生成活性氧自由基(ROS)，ROS 和四環素及其氧化物結合形成的復合物能夠與四環素分子發生反應生成各種氧化產物，從而加快四環素的降解[42-43].因此，在四環素濃度較低的情況下，鐵碳填料的添加也可能對四環素的去除起到了積極的作用，CCW 系統中四環素對NH4+-N 及TN 的去除抑制作用不大.

圖5 濕地系統啟動期NOx--N 的積累Fig.5 The accumulation of NOx--N during the start-up period of wetland system

2.2 啟動期生物量分布

判斷微生物的生長情況最直接最有效的方法是生物量的測量.圖6 為啟動完成后兩組系統6 個反應器沿程的微生物分布情況.由于中層為小粒徑填料，堆積密度較高，可以承載更多的微生物，一級系統中TC 組和對照組生物量均表現為中層?下層?上層.二級CCW 系統中TC 組生物量表現為中層?上層?下層，二級PCW 系統中TC 組生物量表現為上層?中層?下層；而二級CCW 系統和二級PCW 系統中對照組生物量均為上層最大.TC 組和對照組沿程生物量的差異可能是由于受到四環素的影響，并且生物量大小與基質的比表面積和堆積密度有關，因此不同系統不同填料深度的生物量大小不同.

圖6 濕地啟動期不同單元沿程生物量分布Fig.6 The biomass distribution of different units along the wetland start-up period

通過兩組系統的對比，四環素的加入會影響生物量的大小，部分區域生物量有所增加，可能是四環素的存在使部分微生物代謝緩慢，對四環素具有抗藥性的微生物大量繁殖，因此，加入四環素在某種程度上會促進生物量的增加.由圖6 可見，二級PCW 系統中生物量高于二級CCW 系統，但根據對污染物去除情況的分析可知，生物量越高并不一定就意味著對污染物的去除率就越高.

2.3 啟動期微生物掃描電子顯微鏡(SEM)分析

圖7 為啟動運行前填料及運行一個月后填料(均取自2 號取樣口且生物膜附著較明顯的陶粒顆粒)的表面SEM 圖.從圖7(a)可以看出，原材料表面粗糙，這種結構有利于微生物的附著.當生物膜形成之后，可以看出填料表面較為光滑，明顯被大量微生物菌群附著，實際中對比填料發現其表面生物膜由淡黃色變成棕褐色.這濕地系統內生物系統已經穩定，形成了微生物群落.TC 組表面的微生物膜比對照組覆蓋的微生物菌群多，且更為光滑，表明少量四環素作為補充碳源被微生物吸收利用，可以促進系統中某些耐藥菌的增長.由于是運行初期，四環素未產生抑制作用，但由于四環素一直作用于生物膜上，會使生物膜細菌變得敏感脆弱，對后期運行中污染物的去除產生影響.二級CCW 系統表面生物膜較二級PCW 系統附著更明顯，說明加入鐵碳填料為微生物提供了更多的營養物質，對微生物生長提供了有利條件.

圖7 濕地啟動期生物膜SEM 圖Fig.7 SEM of biofilm in wetland startup period

2.4 啟動期微生物群落分析

2.4.1 Alpha 多樣性分析

2.4.1.1 Alpha 多樣性指數

為了探究加入少量四環素對微生物群落機制的影響，對各系統菌群群落進行了研究.基于Chao1 指數和Observed_species 指數(見圖8)可以看出：TC 組中菌群豐富度最高的是二級CCW 系統，且上層最高；對照組中菌群豐富度最低的是二級CCW 系統，最高的是一級系統.一級系統的進水為微生物提供了大量的營養物質，使其可以加快繁殖生長，增加微生物的豐富度.由于四環素的加入，TC 組二級CCW 系統與二級PCW 系統中抗生素可能被作為補充碳源供微生物利用，二級CCW 系統中四環素與鐵碳協同具有促進微生物生長的作用，因此TC 組中二級CCW 系統上層菌群豐富度最高.從Shannon-Wiener 指數、Simpson 指數及Palou′s evenness 指數可知，TC 組中二級PCW 系統上層菌群多樣性最高，其次是一級系統，且一級系統優勢種群最明顯，這是由于大量營養物質存在于一級系統，加之潮汐流的運行方式可以為微生物提供氧及營養物質的交替，促進物種豐富度增高[30].TC 組中二級CCW 系統微生物群落多樣性高于二級PCW 系統，進而驗證鐵碳可以促進微生物生長，強化復合人工濕地的脫氮除磷.

圖8 Alpha 多樣性指數箱狀圖Fig.8 Alpha diversity index box chart

2.4.1.2 稀疏曲線

圖9 為啟動期微生物測序的稀疏曲線.由圖9 可見，隨著測序深度的不斷增加，曲線還未呈現平緩趨勢，說明目前在啟動期多樣性尚未接近飽和.啟動期結束后，對照組一級系統的微生物多樣性最大，二級CCW 系統的微生物多樣性最低，這與Alpha 多樣性指數的分析結果相同.

圖9 樣本稀疏曲線圖Fig.9 Sample sparse curve graph

2.4.2 微生物群落物種相對豐富度變化

用高通量測序技術研究TC 組和對照組物種的水平分布，探究物種種類及數量的變化情況.從圖10(a)可以看出，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)和綠灣菌門(Chloroflexi)均為人工濕地常見的菌門.TC 組和對照組的3 個不同系統不同沿程的優勢門都為Proteobacteria，占所有檢測到微生物的40.6%～71.04%.它包含很多脫硝除磷的細菌，TC 組和對照組中一級系統的Proteobacteria 均大于二級系統，一級系統上層變形菌相對豐度大于中層和下層，與一級系統去除廢水中大量污染物的研究結果相對應.Proteobacteria豐富度在TC 組一級系統和二級PCW 系統中均大于對照組，由于變形菌對抗生素具有高度耐受性，同時少量抗生素可作為營養物質供變形菌生長，所以該門豐富度的增加與少量四環素的加入有關[44].Hedrich等[45]研究表明，Proteobacteria 中存在鐵氧化細菌，進而促進氮磷的去除.Bacteroidetes 具有降解大分子物質的能力，可以通過許多酶催化反應促進抗生素等有機物的降解[46].在二級CCW 系統和二級PCW 系統中，加入少量四環素后Bacteroidetes 豐富度略增加，二級PCW 系統中層增加較為明顯，而一級系統上層則豐富度降低，可能是由于一級上層系統在加入少量四環素后更適合變形菌門(Proteobacteria)的生長.與二級PCW 系統相比，二級CCW 系統中的鐵碳填料能夠將大分子物質轉變為小分子物質，促進Proteobacteria和Bacteroidetes的生長，從而促進NH4+-N 的去除.Firmicutes 具有極端條件耐受性和低生物利用度[47]，因此加入四環素后系統中Firmicutes 豐富度并未降低.Proteobacteria、Firmicutes 與Chloroflexi 都可以對氮的降解起到積極作用.

圖10 TC 組和對照組細菌群落結構的分布Fig.10 The distribution of bacterial community structure in TC group and control group

TC 組和對照組中存在的微生物在綱水平的主要物種組成情況如圖10(b)所示，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)都屬于Proteobacteria.通過不同系統不同沿程的對比，Gammaproteobacteria 的相對豐度最高，占33.30%～55.34%，其中對照組二級CCW系統中層最高.Gammaproteobacteria 在人工濕地中可參與CODCr的降解，一定程度上也促進了氮的去除.在加入少量四環素后，較利于Alphaproteobacteria 的生長，它在硝化進程中具有重要作用，與對照組相比，一級系統上層擬桿菌綱(Bacteroidia)和彎曲桿菌綱(Bacteroidoa)的豐富度降低較為明顯.除此之外，與對照組相比，TC 組出現了硝化螺旋菌綱(Nitrospira)，其含有許多可以降解抗生素的酶，對四環素的降解有重要意義.

TC 組和對照組屬水平上微生物的組成如圖10(c)所示，馬里諾桿菌屬(Marinobacter)為系統中的優勢屬，其中，對照組中二級CCW 系統中層其相對豐度最高，TC 組一級系統和二級CCW 系統菌群豐富度較低，說明添加鐵碳會促進馬里諾桿菌屬(Marinobacter)的生長繁殖，這是由于Marinobacte利用氧和硝酸鹽作為末端電子受體，鐵作為電子供體[48]，使其菌屬本身更有利于在系統中生存，而四環素的加入可在某種程度上抑制該菌的生長和繁殖.硫螺菌屬(Sulfurospirillum)是一類厭氧菌屬，四環素的加入對一級上層中Sulfurospirillum產生了明顯的抑制作用，而二級CCW 系統對其豐富度產生了促進作用，即鐵碳填料為Sulfurospirillum提供了有利的生存條件.Sulfurospirillum的存在可以促進NO3-和NO2-的去除[49]，因此二級CCW 系統對NO3-和NO2-的積累量少于二級PCW 系統，促使系統TN 濃度降低.食烷菌屬(Alcanivorax)是一類有機污染物降解菌屬，有利于降解四環素，也可以利用四環素作為碳源和能源物質生長.在兼性厭氧的條件下，食烷菌屬(Alcanivorax)通過硝酸鹽為電子供體獲得能量進行生長繁殖.索氏菌屬(Thauera)和副球菌屬(Paracoccus)是TC 組特有的兩種優勢屬，都是革蘭氏陰性菌，具有反硝化能力.當NO3-、NO2-或NO 存在時，其作為電子受體供菌屬厭氧生長，對濕地系統中累積的硝酸鹽的去除發揮了重要作用.其中二級CCW 系統中Thauera的物種豐富度要高于二級PCW 系統，因此也再次解釋了二級CCW 系統中硝酸鹽積累量低的原因.“Others”在微生物屬水平占比較高，尤其在TC 組一級系統上層，它是系統中未經鑒定的新物種，可能對系統產生重要影響.

3 結論

a) 兩組潮汐流-潛流復合人工濕地系統中污染物的去除均以一級系統處理為主.加入0.2 mg/L 的四環素對常規污染物的去除存在一定的抑制作用，使各種污染物的平均去除率降低0.59%～9.57%；二級CCW 系統比二級PCW 系統具有更好的去除效果，鐵碳填料的加入在不同方面促進不同污染物的去除，使各污染物平均去除率提高了0.46%～5.81%.CODCr、TP、NH4+-N 和TN 出水濃 度分別 在21.85～24.54、0.12～0.20、0.18～0.71 和7.16～9.28 mg/L 之間.

b) 啟動期加入0.2 mg/L 的四環素對人工濕地系統生物量的增加沒有產生抑制作用.對照組中，二級CCW 系統生物量低于二級PCW 系統，鐵碳的加入并未對生物量的增加提供有利條件；TC 組中，通過啟動前后SEM 圖分析，少量四環素的加入對填料表面生物膜產生的作用較小，而鐵碳填料的加入使TC 組二級CCW 系統中填料表面的生物膜量高于TC 組二級PCW 系統.

c) Proteobacteria 促進系統反硝化進程且對抗生素具有高耐受性，對氮磷的去除也具有重要作用.Bacteroidetes 的存在利于抗生素等有機大分子分解.與二級PCW 系統相比，鐵碳填料為Proteobacteria 和Bacteroidetes 提供了有利的生長條件，從而促進二級CCW 系統中NH4+-N 的去除.四環素的存在對Marinobacter具有抑制作用，而鐵碳填料對其具有促進作用.因此，四環素和鐵碳填料的長期作用下會改變系統微生物群落中菌群的豐富度和多樣性.