納米鐵改性生物炭載體強化厭氧氨氧化菌富集與脫氮效果研究

王俊杰，楊津津，常根旺，李紹康，侯軍華，鐘根茂，白順果，李 翔*

1.河北農業大學城鄉建設學院，河北 保定 071001

2.中國環境科學研究院，國家環境保護地下水污染模擬與控制重點實驗室，北京 100012

厭氧氨氧化 (Anaerobic ammonia oxidizing，ANAMMOX)自1995 年被發現以來，已被廣泛用作一種從廢水中去除銨(NH4+)的節能生物技術[1].迄今為止，基于ANAMMOX 的工藝在高氮廢水的生物脫氮中受到廣泛關注[2-3].與傳統硝化-反硝化技術相比，ANAMMOX 技術具有許多優點，包括較低的需氧量、較少的污泥產量、較高的氮負荷率和無需外加碳源[4-6].根據目前的文獻[7]分析，厭氧氨氧化菌(AnAOB)其中的3 個屬，分別為CandidatusJettenia、Candidatus Brocadia和CandidatusKuenenia.

AnAOB 生長條件苛刻，生長緩慢和富集困難極大程度地限制了ANAMMOX 工藝的工程化應用[8].如何實現AnAOB 快速富集是ANAMMOX 工藝大規模應用的技術難題之一.已有研究[9]表明，采用生物膜工藝有助于保持較高的ANAMMOX 微生物量，提升ANAMMOX 反應器的抗沖擊負荷，從而提升ANAMMOX 反應器脫氮穩定性[10].生物膜載體對AnAOB 的親和力是影響生物膜形成速度、穩定性和菌群結構的重要因素[11].傳統的生物膜載體有沸石、聚乙烯環、活性炭、海綿、凝膠載體、生物炭、塑料空心圓柱體和陶瓷等.其中BC 具有較大的比表面積、骨架和電子傳遞能力[12]，其不僅能介導AnAOB 進行電子傳遞，還能強化AnAOB 穩定脫氮.如Chen 等[7]研究發現，BC 促進了電子轉移能力，導致負責ANAMMOX 途徑的功能基因增加.但由于傳統載體親水性、微生物親和力不足，且AnAOB 生長極其緩慢，阻礙了ANAMMOX 生物膜的快速形成.鐵元素強化ANAMMOX 反應的研究也層出不窮，已有研究表明，nZVI 具有更大的比表面積、更強的還原性，為微生物提供更優異的促進效果，因此受到越來越多的關注[13].同時鐵是AnAOB 生長所必需的元素，也是合成參與其代謝的多種含血紅素酶所必需的元素.添加適量的鐵可以促進AnAOB 的生長，縮短ANAMMOX裝置的啟動時間[14].此外，nZVI 可以通過消耗殘留的溶解氧被氧化為Fe2+和Fe3+，為AnAOB 生長提供厭氧環境[15].如萬莉等[16]研究發現，在UASB 裝置中添加零價鐵以后，裝置中同時出現反硝化、ANAMMOX等反應，其中ANAMMOX 占據主導地位，而nZVI@BC材料富集AnAOB 的研究工作較少.本文以傳統BC作為骨架，在其表面負載nZVI 以增強其對AnAOB的親和性，為實現ANAMMOX 生物膜的快速形成、強化AnAOB 的富集提供了新的思路.

本文制備了nZVI@BC 載體，構建了ANAMMOX載體生物膜復合系統，并通過對比投加不同載體的ANAMMOX 裝置的脫氮性能、載體表面特征和微生物群落結構變化，探究了nZVI@BC 載體對AnAOB富集的效果，以期為AnAOB 的高效富集提供理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 納米鐵改性生物炭載體的制備和改性前后載體表征測試分析

BC 的原材料是核桃殼，其是在600 ℃的高溫下充入氮氣煅燒得到.nZVI@BC 是通過“FeSO4浸潤NaBH4液相還原”法制備[12].將所得的樣品使用去離子水和無水乙醇清洗3 次，在恒溫干燥箱內以60 ℃烘干6 h，即得到nZVI@BC.為防止nZVI 氧化，用干燥密封袋封裝且4 ℃保存.制備過程的反應方程式如式(1)所示.

利用X 射線衍射儀(XRD，BRUKER OPTICS，德國)分析不同載體表面元素，采用掃描電子顯微鏡(SEM，Thermo Fisher Scientific，美國)分析不同載體形貌，利用比表面積分析儀(Micromeritics，美國)分析不同載體比表面積，利用納米粒度電位儀(Malvern，英國)分析不同載體表面Zeta 電位.

1.2 接種污泥

ANAMMOX 污泥取自實驗室穩定運行3 年的ANAMMOX 反應器[17]，接種后每個ANAMMOX 裝置中初始混合液懸浮固體濃度(MLSS)為4 717 mg/L、揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)為8 312 mg/L，MLSS/MLVSS(濃度比)為0.567，每組裝置投加的懸浮污泥量為0.2 L.

1.3 實驗用水

進水采用人工模擬廢水，其中各組分的濃度如表1 所示.本實驗采用無水Na2SO3進行化學脫氧[17]，實驗裝置進水中投加的無水Na2SO3濃度為0.1 g/L，其對微生物和基質濃度幾乎不產生影響[18]，且化學脫氧的反應式如式(2)所示.實驗進水中添加了微量元素Ⅰ和Ⅱ，其組成和濃度如表2 所示.

表1 人工模擬廢水組成及濃度Table 1 Artificial simulation of wastewater composition and content

表2 微量元素組分及濃度Table 2 Trace element fractions and contents

1.4 實驗裝置和運行條件

實驗裝置容積為0.5 L，其模擬進出廢水體積為0.2 L，水力停留時間(HRT)為24 h.實驗裝置外部用錫紙遮光防止藻類生長，在恒溫水浴搖床(33 ℃、120 r/min)中進行富集.設立2 組相同的ANAMMOX裝置(見圖1)，其中R1裝置添加BC 載體，R2裝置添加nZVI@BC 載體.

圖1 ANAMMOX 實驗裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the ANAMMOX experimental setup

1.5 檢測項目與方法

每日采用文獻[17]中的方法檢測裝置進出水水質，其中NH4+-N 濃度采用納氏試劑分光光度法測定，NO2--N 濃度使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定，NO3--N 濃度使用氨基磺酸分光光度法測定.

分析接種污泥和運行20 d 時不同載體表面生物膜中污泥的微生物群落結構，采用文獻[8]中報道的常用于檢測Anammox 系統微生物群落結構的引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和 806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，針對細菌16S rRNA基因在V3～V4 區域上進行PCR 擴增，與AnAOB 相關的高通量測序工作在Illumina MiSeq 平臺進行.污泥濃度和載體表面生物膜的微生物量采用重量法測定.

2 結果與討論

2.1 載體生物膜表面特征分析

載體生物膜表面特征對微生物附著生長具有關鍵作用.使用X 射線衍射(XRD)對BC 和nZVI@BC載體進行表征分析，驗證nZVI 在BC 表面的負載效果，結果如圖2(a)所示.2θ的掃描范圍為3°～70°，在44.80°和64.90°時出現衍射峰[13,19]，說明nZVI 成功負載至BC 上.

圖2 BC 和nZVI@BC 載體的XRD、傅里葉光譜和SEMFig.2 XRD,Fourier spectrum and SEM of BC and nZVI@BC carriers

通過對比改性前、后載體的SEM 圖和比表面積數據可知，BC 具有多孔結構，表面呈魚鱗狀〔見圖2(c)〕，比表面積(47.17 m2/g)較大，為nZVI 提供了良好的負載位點；nZVI@BC 出現更多微小孔隙〔見圖2(d)〕，比表面積(210.82 m2/g)明顯增大(見表3)，這是因為微觀球型且直徑較小的nZVI 在BC 表面成功負載.因此載體的表面孔隙越豐富、比表面越大，越能為微生物提供更多的附著位點.

表3 不同載體比表面積、Zeta 電位和表面元素含量對比Table 3 Comparison of specific surface area,zeta potential and surface element content of different carriers

通過對比改性前、后載體表面Zeta 電位可知，BC 的表面電位值為-45.2 mV，nZVI@BC 的表面電位值為-42 mV，這說明載體改性前、后Zeta 電位值沒有發生太大變化(見表3)，其原因可能是載體表面顆粒帶有較多負的或正的電荷，具有很高的Zeta 電位[20].而載體顆粒表面的Zeta 電位能反映載體的聚集穩定性，它們會相互排斥，從而達到載體的穩定性，為微生物的附著生長提供一個穩定的條件.

如圖2(b)所示，在3 418 cm-1處產生的吸收峰主要由-OH 基團伸縮振動所引起，在1 630 cm-1處的吸收峰主要是由C=O 和C=C 伸縮振動產生的，由于-OH、C=O 和C=C 都是電負性官能團，說明BC 創造了良好的負載條件，使nZVI 更容易負載在其表面[21].在BC-nZVI 中新的吸收峰(1 114 cm-1處)也發生了偏移，這說明BC 與nZVI 可能通過物理或化學作用形成了nZVI@BC[21].在富集結束以后，3 418 cm-1處產生的吸收峰值明顯減弱，這有可能是載體表面生物膜存在污泥將載體包裹在里面.

2.2 ANAMMOX 裝置脫氮效果

為了使裝置能夠進行ANAMMOX 反應，整個實驗裝置進水NH4+-N 與NO2--N 的基質濃度比采用理論值1∶1.32[2].經過40 d 的運行，R1和R2裝置表現出不同的脫氮效果，其中R1和R2裝置的NH4+-N 去除率穩定達到90%界限時分別使用了34 d 和17 d，NO2--N 去除率穩定達到90%界限時分別使用了29 d 和13 d，比之前類似的研究花費時間更短，這一方面是因為接種的是成熟的AnAOB 污泥，另一方面是因為改性后的載體比表面積大.由此可見，添加nZVI@BC 使R2裝置 的NH4+-N 和NO2--N 去除率達到90%所需的時間均比R1裝置短.

第Ⅰ階段(1～10 d)，ANAMMOX 裝置進水NH4+-N濃度為50 mg/L，進水NO2--N 濃度為66 mg/L，HRT為24 h.R2裝置出水NH4+-N 濃度在2～6 d 不穩定且有明顯波動，其中第4 天時出水NH4+-N 濃度達到45.93 mg/L，隨后出水NH4+-N 濃度呈現大幅下降，這是由微生物自溶釋放有機氮引起的，剩余的微生物群落將有機氮轉化為NH4+-N[22]，導致第Ⅰ階段ANAMMOX 裝置運行效果不穩定，并且裝置中AnAOB 的活性較低，所以裝置一開始運行效果不佳〔見圖3(a)〕.R1裝置出水NO2--N 濃度逐漸增加，與此同時，R2裝置出水NO2--N 濃度穩定，但在第7～10 天時，R1裝置出水NO2--N 濃度出現明顯的上升，但出水NO2--N 濃度始終低于進水NO2--N 濃度〔見圖3(b)〕，污泥中的反硝化微生物直接利用NO2--N 和菌體自溶過程中釋放的有機碳源進行反硝化作用[8].由于R2裝置出水NH4+-N 濃度出現大幅變化，導致R2裝置的基質化學計量比高于1.32〔見圖3(c)〕.裝置出水NH4+-N濃度和出水NO2--N 濃度均有較大的變化，導致NRR呈現下降趨勢〔見圖3(d)〕.第10 天，R1和R2裝置的TN 去除率分別達到45.18%和69.7%〔見圖3(e)〕.在第Ⅰ階段，ANAMMOX 未占主導地位，但R2裝置的去除率仍要高于R1裝置.

圖3 R1 和R2 裝置的脫氮性能、化學計量比和比活性變化Fig.3 Variation of nitrogen removal performance,stoichiometric ratio and specific activity of R1 and R2 devices

第Ⅱ階段(11～40 d),裝置的進水NH4+-N 濃度從50 mg/L 逐步提升到125 mg/L，進水NO2--N 濃度從66 mg/L 逐步提升到165 mg/L，HRT 為24 h〔見圖3(a)(b)〕.與第Ⅰ階段相比，第Ⅱ階段出水NH4+-N 濃度和出水NO2--N 濃度存在小幅波動，裝置出水整體趨于穩定.這可能是因為載體為微生物生長提供了不同的生態位點，實現了氨氧化菌(AOB)和AnAOB 等不同菌種的協同脫氮[23]〔見圖3(c)〕，R1和R2裝置的NH4+-N 消耗量與NO2--N 消耗量的比值已經趨近于理論值1∶1.32，NH4+-N 消耗量與NO3--N 生成量的比值已經趨近于理論值1∶0.26，ANAMMOX 趨于穩定并且占據主導的脫氮地位.如圖3(d)(e)(f)所示，R1和R2裝置TN 去除負荷(NRR)的最大值分別為0.250 0、0.255 4 kg/(m3·d)，TN 去除率的最大值分別為86.99%、89.65%，這與其他生物膜反應器類似[24]，這表明AnAOB 可以保留在載體內.該研究中NH4+-N 和NO2--N 的進水濃度最高分別為125 和165 mg/L，且NH4+-N 和NO2--N的去除率均在95%以上，生成的NO3--N 濃度相差不大，最終導致TN 去除負荷相差甚微.BC 和nZVI@BC載體為AnAOB 提供附著位點，提高了微生物的富集密度，江宇勤等[25]研究發現，填料的比表面積越大，越有利于微生物附著、生長和生物膜形成，所以R2裝置的去除率高于R1裝置.在第Ⅱ階段，ANAMMOX裝置穩定運行，與R1裝置相比，R2裝置具有更高的脫氮效率和更好的抗沖擊性.

2.3 厭氧氨氧化生物膜的變化特征

紅色是AnAOB 最顯著的特征之一，載體表面生物膜的紅色色度與ANAMMOX 活性呈顯著相關，可以作為一種直觀的ANAMMOX 活性指標[26].載體表面生物膜顏色的變化如圖4 所示.第25 天時觀察BC 和nZVI@BC 載體富集AnAOB 的效果，發現載體表面生物膜出現紅色的污泥，且經過40 d 的培養，BC 和nZVI@BC 載體表面生物膜附著明顯的紅褐色污泥〔見圖4(a)(b)〕.這是因為AnAOB 利用含細胞色素c 在內的多種蛋白質，完成了菌體的生長、繁殖和代謝，其活性明顯提高[17]，促使本研究中載體表面生物膜紅色污泥也明顯增多.BC 載體富集的微生物量為2.3 mg，nZVI@BC 載體富集的微生物量為53.4 mg，根據載體生物膜表面富集生物量的結果，復合載體表面AnAOB 的微生物量高于普通載體表面，載體的比表面積是影響生物膜生長狀況的首要影響因素[25]，因為nZVI@BC 載體的比表面積遠大于BC 載體，所以R2裝置載體生物膜表面的AnAOB 量是R1裝置載體生物膜表面的AnAOB 量的23 倍.實驗結束時，在R2裝置中接種的絮凝污泥有ANAMMOX 顆粒產生〔見圖4(c)〕.裝置添加載體后，顆粒污泥粒徑的減少有所緩解，可以推斷出ANAMMOX 裝置中添加nZVI@BC載體能夠促進AnAOB 進行造粒.如圖4(d)(e)所示，BC 和nZVI@BC 載體表面均出現球狀菌，并呈現ANAMMOX 富集物的典型“花椰菜”結構[27].在本研究中，R2裝置的色度和富集的微生物量均比R1裝置效果顯著，R2裝置富集AnAOB 的效果比R1裝置富集AnAOB 的效果優異.

圖4 BC 和nZVI@BC 載體富集厭氧氨氧化菌的變化和實驗結束時其SEM 示意Fig.4 Changes of anaerobic ammox bacteria enriched by BC and nZVI@BC carriers and their SEM diagram at the end of the experiment

2.4 微生物群落結構分析

2.4.1 微生物多樣性變化特征

對接種時絮凝污泥(R0)、第20 天BC(R1裝置)和nZVI@BC(R2裝置)表面生物膜進行微生物多樣性分析.覆蓋率(Coverage)均大于99%，結果較為充分，表明檢測樣品的細菌可以代表ANAMMOX 裝置內大部分微生物群落的變化情況[8].Shannon-Wiener和Simpson 指數可以用來估算樣本中微生物群落的多樣性，Shannon-Wiener 指數越大代表微生物群落多樣性越高，Simpson 指數越大代表微生物多樣性越低.經過20 d 的富集，Shannon-Wiener 指數呈下降趨勢，Simpson 指數呈上升趨勢，其中R2裝置的Shannon-Wiener 指數由3.516 降至3.209，Simpson 指數由0.078升至0.102；R1裝置的Shannon-Wiener 指數由3.516降至3.329，Simpson 指數由0.078 升至0.088.這說明添加載體后，隨著載體富集AnAOB 的進行，微生物逐漸適應新的環境，微生物群落多樣性逐漸減少，同時優勢物種占比增大，其相關的功能菌逐漸占據絕對優勢.

2.4.2 微生物門水平和屬水平結果分析

ANAMMOX 裝置載體生物膜微生物的優勢菌門(相對豐度?5%)包括綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)〔見圖5(a)〕.接種時的AnAOB 的優勢菌門為Chloroflexi(占47.32%)、Proteobacteria (占20.65%)、Planctomycetes(占12.4%).如圖5(c)所示，經過20 d 的培養，Planctomycetes 在R1裝置相對豐度由12.4%變為10.47%，R2裝置相對豐度由12.4%變為29.15%，這說明Planctomycetes 的相對豐度在R1裝置中減少了1.93%、在R2裝置中增加了16.75%，在ANAMMOX裝置中引入nZVI@BC 載體進行富集，生物膜微生物中Planctomycetes 的相對豐度大幅提升，研究表明，nZVI@BC 載體富集AnAOB 過程中，Planctomycetes能夠成為優勢菌門.Chloroflexi 在R1裝置的相對豐度由47.32%變為23.81%，在R2裝置的相對豐度由47.32%變為26.41%，其在R1、R2裝置中分別減少了23.51%、20.91%，同時Chloroflexi 和Planctomycetota是與脫氮相關的微生物[28]，Chloroflexi 是AnAOB 的協同菌門，促進ANAMMOX 生物膜的形成，說明污泥馴化過程中Chloroflexi 和Planctomycetota 的相對豐度相差甚微.Proteobacteria 是AnAOB 的協同菌門[2]，是參與硝化和反硝化過程的革蘭氏陰性菌(其中包括大多數厭氧、好氧和兼性細菌)[29]，此過程與脫氮密切相關.在R1裝置中Proteobacteria 的相對豐度由20.65%變為23.27%，在R2裝置中其相對豐度由20.65%變為21.67%，因此在載體生物膜中其相對豐度占比與其他主要菌門的相對豐度類似[17].在生物膜裝置中，Planctomycetes 的相對豐度會有一定程度的提高，Chloroflexi 和Proteobacteria 是生物膜中AnAOB 的重要組成成分，這與Cao 等[30]研究相似，Proteobacteria也是作為填料ANAMMOX 系統中的重要菌群.有研究[31]表明，隨著AnAOB 的快速生長和富集，代謝產物將被分泌并釋放到液體中，這可以作為不同類型異養細菌的有機碳源，強化異養細菌的快速生長，促進Proteobacteria 相對豐度的提升，進一步佐證了在ANAMMOX 裝置添加nZVI@BC 載體能夠提升相關微生物的相對豐度.

圖5 微生物群落結構分析Fig.5 Analysis of microbial community structure

對ANAMMOX 裝置在菌屬水平上的菌群結構進行分析，結果如圖5(b)所示.根據已有研究[7]可知，Candidatus_Jettenia、Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia是最常見的AnAOB.根據本次污泥測序結果可知，屬于AnAOB 菌屬的是Candidatus_Kuenenia和Candidatus_Jettenia.Candidatus_Kuenenia在R1裝置中其相對豐度由8.48%減至7.49%，而在R2裝置中其相對豐度由8.48%增至23.76%，這表明在ANAMMOX 裝置中添加nZVI@BC 載體能夠大幅提升AnAOB 屬Candidatus_Kuenenia的相對豐度；同時，Candidatus_Kuenenia具有更高的底物親和力及更大的環境耐受性，說明投加的nZVI@BC 載體對上述微生物的底物親和力及環境耐受性增強.另外，nZVI@BC 載體生物膜表面微生物的相對豐度要高于BC 載體生物膜表面微生物的相對豐度，這表明nZVI@BC 載體能夠提升AnAOB 屬的相對豐度.反硝化菌屬Denitratisoma在R1和R2裝置中的相對豐度由10.57%分別變為19.36%和17.38%，根據已有的研究[32]表明，Denitratisoma為AnAOB 提供底物，促進其生長，起到協同作用.BC 可以促進Denitratisoma、Candidatus_Kuenenia的相對豐度增加，同時在ANAMMOX 裝置中，添加鐵離子能夠促進AnAOB生長.這表明在ANAMMOX 裝置中添加nZVI@BC載體能夠提升AnAOB 在Planctomycetes 中的占比，增強ANAMMOX 反應裝置的優勢菌屬.

3 結論

a) nZVI@BC 載體中nZVI 成功鑲嵌到BC 的空隙中，增大了載體比表面積，使nZVI@BC 載體具有更好的微生物親和性.

b) 通過不斷的提升進水氮負荷，裝置中先出現惡化現象，隨后出現ANAMMOX 反應.在ANAMMOX裝置中nZVI@BC 載體比BC 載體具有更好的抗沖擊性.

c) 本研究中BC 載體和nZVI@BC 載體顏色逐漸變為紅褐色，且nZVI@BC 載體富集的AnAOB 量要比BC 載體多，絮凝污泥AnAOB 裝置中添加nZVI@BC載體，使裝置中部分絮凝污泥聚集形成顆粒狀，創造了ANAMMOX 裝置中載體生物膜-顆粒污泥的優越條件，提升了顆粒污泥和生物膜系統的協同作用.

d) 微生物群落分析結果表明，經過20 d 的富集，BC、nZVI@BC 載體生物膜中主要的AnAOB 菌屬是Candidatus_Kuenenia.nZVI@BC 載體生物膜中AnAOB 的相對豐度明顯高于BC 載體，nZVI@BC 載體的添加能夠有效促進AnAOB 的富集.

e) 本實驗是采用模擬廢水進行富集，為AnAOB的富集創造了理想條件，但今后進一步的研究中可以采用真實廢水進行富集，使AnAOB 適應實際情況，為規模化、工程化做相應的準備.