輝光放電等離子體降解啤酒中T-2毒素

王小博

劉健南1

鄭 琳1

陳冰冰1

馮澤君1

鄧 旗2

(1. 佛山職業技術學院,廣東 佛山 528137;2. 廣東海洋大學食品科技學院,廣東 湛江 524088)

T-2毒素是由鐮孢菌屬真菌產生的一種次級代謝產物,是毒性最強的一種A型單端孢霉烯族化合物毒素。其在自然界中分布廣泛,常常污染糧谷類產品及其制品,在大麥、小麥、玉米等糧農作物以及動物飼料中污染率高達80%以上[1]。徐哲等[2]研究發現,180份中國小麥樣品中鐮刀菌毒素檢出率高達95%。T-2毒素具有很強的致毒效應,機體長期低劑量攝入可導致血液及淋巴系統受到侵害,造成內分泌紊亂及免疫功能下降等,嚴重影響人類健康[3-5]。廣東省年平均氣溫較高、濕度較大,糧谷作物在放置過程中極易發霉變質,產生真菌毒素,尤其是大麥、小麥變質后極易產生T-2等真菌毒素。

輝光放電等離子體(glow discharge plasma,GDP)是一種新型的、綠色環保的電化學高級氧化技術,也是一種能夠在水溶液中通過直流放電產生等離子體的非熱處理技術[6-7]。GDP是指在封閉的容器內施加一定的電場促使其不斷產生具有強氧化性的高活性粒子(·OH、H2O·、H2O2等),溶液中的有機物在光、電等媒介下可與生成的高活性粒子發生反應,并最終徹底分解為CO2、H2O和簡單無機鹽,具有降解效率高、能耗低、操作簡單、不產生二次污染等特點[8],已被廣泛應用于水體中有機污染物的消解[9],但將其用于啤酒中 T-2毒素的降解及其對啤酒品質影響的研究尚未見報道。研究擬構建GDP降解裝置,考察GDP條件對啤酒中T-2毒素的降解效果,探討GDP降解T-2毒素的最佳工藝條件;并分析GDP對啤酒理化指標的影響,為GDP脫除食品中真菌毒素的研究與應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T-2毒素標準品:純度≥98%,上海穎心實驗室;

甲醇、乙腈:色譜純,純度≥ 99.9%,南京化學試劑股份有限公司;

甲酸、乙酸乙酯:分析純,天津光復試劑有限公司;

乙酸銨:阿拉丁試劑(上海)有限公司;

青島啤酒:市售。

1.2 儀器與設備

輝光放電降解裝置:實驗室自主構建(圖1);

圖1 輝光放電降解裝置結構示意圖

超高效液相色譜—三重四極桿質譜聯用儀:TSQ Quantiva型,美國Thermo Fisher公司;

電子天平:FA1104A型,上海精天電子儀器有限公司;

渦旋震蕩儀:Vortex 2型,德國IKA公司;

冷凍離心機:KT7-900-429型,新加坡KENTA公司;

氮吹儀:YT-D24型,山東云唐智能科技有限公司;

超聲波提取器:KQ-800B型,昆山舒美超聲儀器有限公司;

全自動啤酒分析儀:5611型,長沙市馭儀電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含T-2毒素樣品的制備 取10 mg T-2毒素標準品,用乙腈溶解、定容配制成質量濃度為100 μg/mL的T-2毒素標準儲備液。分別取0,1,3,5,7,10 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中,啤酒定容,得到質量濃度分別為0,1,3,5,7,10 μg/mL的含T-2毒素的啤酒溶液。

1.3.2 GDP降解啤酒中T-2毒素工藝參數優化

(1) 單因素試驗:取10 mL含T-2毒素的啤酒于反應器中,在基礎條件(電壓550 V,時間15 min,電流100 mA,T-2毒素初始質量濃度5 μg/mL)下分析GDP裝置放電電壓、作用時間、放電電流和T-2毒素初始質量濃度對T-2毒素降解效率的影響。其中,放電電壓為400,450,500,550,600 V,作用時間為1,3,5,7,10 min,放電電流為5,10,15,20,25 mA,T-2毒素初始質量濃度為1,3,5,7,10 μg/mL。每組試驗重復3次,測定并計算T-2毒素降解率。

(2) 響應面試驗:在單因素試驗基礎上,采用Design-Expert 8.06 軟件的Box-Behnken設計原對GDP降解啤酒中T-2毒素的參數進行四因素三水平的響應面優化。

1.3.3 T-2毒素降解率測定 參照Tahoun等[10]的方法并修改。T-2毒素標準曲線為y=207.9x+330.62,R2=0.999 2。按式(1)計算 T-2毒素降解率。

(1)

式中:

R——T-2毒素降解率,%;

C0——T-2毒素初始質量濃度,μg/mL;

CT——經GDP降解后T-2毒素的質量濃度,μg/mL。

1.3.4 GDP對啤酒理化指標的影響 取10 mL啤酒于反應器內,以響應面優化得到的參數為試驗條件,對啤酒進行GDP處理。GDP處理后,采用啤酒全自動分析儀器法[11]分別測定啤酒的酒精度、色度、pH、原麥汁濃度、濁度、泡持性、總酸度、雙乙酰、苦味值等[12]。

1.3.5 數據處理 采用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行統計分析,采用Origin 8.5 軟件繪圖,采用Design-Expert.V 8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 放電電壓 由圖2可知,GDP放電電壓與T-2毒素降解率呈正比,隨著放電電壓的增加,T-2毒素降解率也隨之增加;當放電電壓為500～600 V時,T-2毒素降解率逐漸趨于平緩;與400,450 V相比,放電電壓為500,550,600 V時,T-2毒素降解率增加顯著(P<0.05)。放電電壓對活性粒子(·OH、·H、H2O2)的產生有顯著影響,當放電電壓較低時,陰極發射的電子在電場中加速獲取的能量較低,從而與陽極尖端氣態水分子發生碰撞,激發氣態水分子發生電離產生的活性粒子較少,最終導致等離子體對T-2毒素的降解效果較弱[7,13]。電壓升高,輝光增強,產生的·OH、·O、·H、H2O2等高活性粒子濃度增加,促使T-2毒素氧化降解效果增強[14]。當活性物質濃度達到一定程度,T-2毒素轉化的反應也逐漸趨于飽和達到平衡狀態[15],與試驗結果一致。綜上,GDP降解T-2毒素的放電電壓控制在 500～600 V較為適宜。

*表示組內比較差異顯著(P<0.05)

2.1.2 作用時間 由圖3可知,隨著作用時間的延長,T-2毒素的降解率逐步增大;當作用時間>10 min時,T-2毒素降解率雖有增加,但增幅較小;與1,5 min相比,作用時間為10,15,20 min時,T-2毒素降解率顯著增加(P<0.05),說明在0～10 min內,輝光放電等離子體中的活性物質主要與T-2毒素發生反應;而10 min后,T-2毒素與活性粒子反應逐漸達到飽和,因此T-2毒素降解速率緩慢。此外,由于反應過程中產生的中間產物消耗了部分活性物質,致使與T-2毒素發生反應的·OH減少[16],反應速率隨著作用時間的延長而減小。因此,GDP降解T-2毒素的作用時間保持在 10～20 min 比較適宜。

*表示組內比較差異顯著(P<0.05)

2.1.3 放電電流 由圖4可知,隨著放電電流的增加,T-2毒素降解率呈先升高后下降趨勢。當放電電流為90 mA時,T-2毒素降解率達到最大,為83.29%;與30,50 mA相比,放電電流為70～110 mA時,T-2毒素降解率顯著增加(P<0.05)。提高放電電流,輸入體系的功率增加,電極間的電場強度增強,形成了較大的微放電密度,電子在電場中獲得更多的能量,加速了高能電子的形成。高能電子產生的速率和數量升高,轟擊能力加強,從而使水分子和氣體分子等更快更多地離解和電離,生成更多的活性物質[17]。過高的放電電流,陽極鉑絲易被熔化損壞,最終造成毒素降解率下降。因此,放電電流控制在 90～110 mA最為適宜。

*表示組內比較差異顯著(P<0.05)

2.1.4 T-2毒素初始質量濃度 由圖5可知,當T-2毒素初始質量濃度≤7 μg/mL時,隨著初始質量濃度的增加,T-2毒素降解率隨之增加;當T-2毒素初始質量濃度>7 μg/mL時,隨著初始質量濃度的增加,T-2毒素降解率增加幅度減緩;與其他質量濃度相比,初始質量濃度為7,10 μg/mL時,T-2毒素降解率增加顯著(P<0.05),說明在一定質量濃度范圍內,溶液的初始質量濃度越大,毒素降解效果越好,與Pu等[18]的結論一致。T-2毒素的初始質量濃度越高,與·OH等發生有效碰撞的概率越大,毒素降解越快。初始質量濃度增大也會增加溶液的電導率,抑制放電過程中流光的形成,使產生的·OH量減少而抑制T-2毒素的降解[19]。因此,T-2毒素初始質量濃度控制在5～10 μg/mL有利于反應的進行。

*表示組內比較差異顯著(P<0.05)

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果 以放電電壓、作用時間、放電電流、T-2毒素初始質量濃度為自變量,T-2毒素降解率為響應值,設計四因素三水平響應面試驗,試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 模型擬合與分析 采用方差分析(ANOVA),二階多項式模型來計算預測的響應,得到啤酒中T-2毒素降解率對放電電壓、作用時間、放電電流和T-2毒素初始質量濃度的回歸模型方程:

Y=82.68+4.38A+9.26B+5.89C+8.84D-1.62AB+0.095AC+2.63AD+2.8BC-6.46BD-2.49CD-5.54A2-7.15B2-4.97C2-7.25D2。

(2)

表3 方差分析

2.2.3 響應面分析 由圖6可知,隨著作用時間與T-2毒素初始質量濃度的升高,T-2毒素降解率呈先增加后減小的趨勢,且曲面陡峭程度明顯;同時,隨著作用時間與放電電流的升高也出現了類似的趨勢,表明放電電流與T-2毒素初始質量濃度、放電電流的交互作用顯著(P<0.05)。

圖6 各因素交互作用的響應面圖

2.3 驗證實驗

經Design-Expert.V 8.0.6軟件計算得到GDP對啤酒中T-2毒素的最佳降解參數為放電電壓572.934 V,作用時間18.072 5 min,放電電流99.236 1 mA,T-2毒素初始質量濃度8.334 4 μg/mL。根據實際情況,調整最佳降解條件為放電電壓570 V,作用時間18 min,放電電流99 mA,T-2毒素初始質量濃度8.5 μg/mL。在此條件下重復5次,T-2毒素降解效率為89.21%,與預測值89.37%接近,因此該響應面優化模型得到的GDP對T-2毒素最佳降解條件準確且有效。

2.4 GDP對啤酒品質的影響

啤酒的質量由其酒精度、原麥汁濃度、泡持性、雙乙酰含量、苦味值等指標共同決定[20],不同的工藝會對啤酒的理化指標產生巨大影響[21]。由表4可知,經GDP處理后,啤酒的酒精度、pH值和泡持性均略微下降,色度值、濁度值、苦味值、雙乙酰含量和總酸含量略微上升,原麥汁濃度不變;與對照組相比,泡持性下降顯著(P<0.05)。啤酒泡持性主要表現在啤酒的起泡性、持久性和附著性方面,是判別啤酒品質的重要因素,能夠直觀評價啤酒質量好壞,其主要受到CO2、泡沫蛋白和異α-酸等因素的影響[22]。經GDP處理后,啤酒中部分CO2發生逸散、泡沫蛋白發生分解,進而導致其泡持性下降。雙乙酰是啤酒發酵過程中的重要代謝產物之一,是啤酒成熟與否的重要標志。啤酒中雙乙酰含量必須<0.10 mg/L,若超過0.2 mg/L,就會產生飯餿味,嚴重影響啤酒品質[23]。雙乙酰是從α-乙酸乳酸轉化中獲得的,GDP處理可促使少量α-乙酸乳酸轉化,導致雙乙酰含量上升。

表4 GDP處理對啤酒品質的影響?

啤酒中含有的酸類達200多種,這些酸及其鹽類控制著啤酒的pH值和總酸含量,適合的酸味會賦予啤酒柔和的口感[24]。啤酒中原有的一部分酸與啤酒中存在的金屬離子相結合[25],經GDP處理后有機酸解離出來,進而導致啤酒pH下降、總酸含量上升。原麥汁濃度主要反映發酵前麥芽汁中含有的可發酵糖含量,是鑒定啤酒品質的一個硬性指標。酒精度、苦味都是影響啤酒口味的重要口感指標,濁度可以直接影響其外觀質量和非生物穩定性,啤酒的顏色更是評定啤酒質量的一項重要指標。啤酒經GDP處理后各指標均符合國標。綜上,經GDP處理后啤酒中各項理化指標雖然會發生改變,但對啤酒品質影響較小。因此,將GDP降解裝置應用于啤酒生產,能夠有效降解原料中的T-2毒素,保障產品安全。

3 結論

輝光放電等離子體降解T-2毒素的最佳工藝條件為放電電壓570 V,作用時間18 min,放電電流99 mA,T-2毒素初始質量濃度8.5 μg/mL,此條件下T-2毒素降解率可達89.21%。經輝光放電等離子體處理后,啤酒的泡持性顯著降低(P<0.05),其他指標無明顯變化。后續可將輝光放電等離子體降解T-2毒素的工藝應用至果汁加工及其他真菌毒素的消解中。