小茴香揮發油β-環糊精包合物的制備、表征及穩定性研究

張雨萌

徐 芳2

姚雨含2

李晨陽2

趙 軍2

(1. 新疆大學生命科學與技術學院,新疆 烏魯木齊 830046;2. 新疆維吾爾自治區藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830004)

小茴香(Foeniculumvulgare)為傘形科茴香屬草本植物茴香的干燥成熟果實,具有散寒止痛、理氣和胃的功效,主要含有揮發油、生物堿、黃酮、脂肪酸、甾醇和糖苷等多種類型的化合物[1]。小茴香揮發油主要含有單萜類化合物和苯丙烷類化合物,具有抗炎鎮痛、抗菌、增加胃腸蠕動等作用。小茴香揮發油中主要成分為反式茴香腦、D-檸檬烯、γ-萜品烯、茴香酮、雌蒿腦、茴香醛。反式茴香腦在小茴香揮發油中的含量可達到65%～80%[2],此類化合物呈油狀具有強烈的茴香香味,存在易揮發、不穩定、對光線和溫度敏感等性質,容易氧化分解變質,給揮發油的貯藏、使用以及開發利用帶來極大不便[3]。

目前,揮發油多選β-環糊精進行包合,β-環糊精利用分子作用力將揮發油包嵌進空腔結構形成包合物,可明顯提高其穩定性,克服揮發性,改善水溶性,降低刺激性氣味,以便揮發油更好地在生產生活中使用。鄭燕菲等[4]采用飽和水溶液法以包合收率為指標,利用β-環糊精包合八角茴香油制備包合物。謝媛等[5]采用細胞破碎法以揮發油包合率和包合收率為指標,利用純膠包合小茴香揮發油制備包合物。已有文獻報道對小茴香包合物中揮發油的控制指標,大多為傳統的包合率和包合收率,對其結構性質鑒定不夠全面。研究擬通過正交試驗優化得到可提高小茴香揮發油包合率和包合產率的包合工藝,并通過掃描電鏡法、薄層色譜法、傅立葉紅外光譜法、差示掃描量熱法4種方法對包合物進行鑒定,以期將該工藝方法推廣應用于食品、醫藥等領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小茴香:河北百合健康藥業有限公司;

β-環糊精:北京鳳禮精求醫藥股份有限公司;

反式茴香腦標準品:成都曼斯特生物科技有限公司;

無水乙醇、石油醚:分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;

甲醇:色譜純,賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 主要設備儀器

高效液相色譜儀:LC-10ATvp型,島津上海實驗器材有限公司;

恒溫磁力攪拌器:85-2型,江蘇金怡儀器科技有限公司;

場發射掃描電子顯微鏡:SU8010型,日立科學儀器北京有限公司;

差示掃描量熱儀:DSC 404F3型,耐馳科學儀器商貿上海有限公司;

傅立葉紅外光譜儀:70 RAM II型,浙江賽德儀器設備有限公司;

澄明度檢測儀:YB-2型,天津大學精密儀器廠;

臺式高速冷凍離心機:TGL-16型,湖南湘儀實驗室儀器開發公司。

1.2 方法

1.2.1 小茴香揮發油制備 采用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮發油。小茴香粉碎過10目篩,稱取500 g小茴香粉末置于圓底燒瓶中,按料液比1∶12 (g/mL)加蒸餾水浸泡4 h,加熱提取5 h。收集蒸餾液,加入約0.1 g/mL的無水硫酸鈉干燥,隨后過濾得到揮發油,得率為1.9 mL/100 g。小茴香揮發油為淡黃色透明油狀物,有輕微的辛辣味,將其置于-20 ℃下貯藏備用。

1.2.2 小茴香揮發油包合物制備工藝研究

(1) 包合物制備:采用飽和水溶液法[6],其流程如下:

β-環糊精8 g→加入6倍量的蒸餾水→磁力攪拌50 ℃→攪拌溶解→揮發油1 mL用無水乙醇4 mL溶解緩慢逐滴加入→恒溫攪拌6 min→冷卻至室溫→4 ℃冷藏24 h→抽濾→石油醚沖洗3次每次1 mL→室溫放置過夜→自然揮干→小茴香揮發油包合物

(2) 正交試驗設計:根據文獻[3]以及預試驗結果確定表1所示的因素及數值對包合物制備的影響較大。設計L9(34)正交試驗優化小茴香揮發油包合物制備工藝條件。

表1 小茴香揮發油包合物制備工藝正交試驗因素水平表

(3) 包合物中反式茴香腦含量測定:適量稱取小茴香揮發油包合物,置于10 mL容量瓶中,用無水乙醇定容,于60 ℃下超聲處理10 min使包合物中的揮發油充分溶解,取出部分溶液加入2 mL EP管中,于16 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min,取上清液,用0.45 μm的有機相濾頭過濾,供高效液相色譜(HPLC)測定反式茴香腦含量。

(4) 包合物中含油率測定:稱取小茴香揮發油包合物,置于500 mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水300 mL,按(2020版《中國藥典》四部通則)測定回收的揮發油含量,至油量不再增加時停止加熱,放置1 h,讀取油量即可。

(1)

式中:

c——揮發油空白回收率,%;

m1——收集到的揮發油質量,g;

m2——加入揮發油質量,g。

(6) 小茴香揮發油及包合物中反式茴香腦含量測定:采用HPLC法,根據文獻[7]修改如下:Shim-pack×C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)和水(B)梯度洗脫;梯度洗脫條件:0～19 min為70%～80% A,20～25 min時為80%～90% A;流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長254 nm,進樣量10 μL。對照品溶液的配制:取適量反式茴香腦對照品,精密稱定后,用無水乙醇稀釋溶解配制成質量濃度為9.60 μg/mL的對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用無水乙醇定容搖勻,按照上述的色譜條件進樣,記錄峰面積,以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。回歸方程為Y=81 823 535.493X+20 181.300,(R2=0.999);線性范圍為0.096～9.60 μg/mL。

(7) 包合率、包合產率及綜合評分計算:包合率為衡量包合效果的主要指標,權重系數定為0.5,反式茴香腦是包合物中揮發油的主要成分,反式茴香腦含量越高,說明包合物中的有效成分含量高,因此權重系數定為0.3。包合產率在實際生產中可反映包合效率,權重系數定為0.2[8]。根據式(2)、式(3)和式(4)分別計算包合率、包合產率和綜合評分。

(2)

(3)

(4)

式中:

E——包合率,%;

采用HRV時域分析和頻域分析法，由計算機自動分析。HRV時域指標:① 全部竇性心搏RR間期的標準差(SDNN)；② 連續24 h正常RR間期標準差的均值(SDNN index)；③ 全程相鄰RR間期之差的均方根值(rMSSD)；④ 全程相鄰心搏RR間期之差值>50 ms的心搏數占心搏總數的百分比(pNN50)。頻域分析指標:低頻功率(LF)、高頻功率(HF)。

m3——包合物中實際含油質量,g;

m4——制備包合物時加入揮發油的質量,g;

F——包合產率,%;

m5——包合物的質量,g;

m6——制備包合物時加入β-環糊精的質量,g;

H——綜合評分;

G——反式茴香腦含量,%;

Emax——包合率的最大值,%;

Fmax——包合產率的最大值,%;

Gmax——反式茴香腦含量的最大值,%。

1.2.3 小茴香揮發油β-環糊精包合物表征

(1) 掃描電鏡(SEM)觀察:根據文獻[9]。稱取β-環糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物各1.0 mg,在電鏡下觀察。

(2) 薄層色譜(TLC)分析:將包合物按1.2.2(4)中的方法提取包合的揮發油。以茴香醛為對照,量取包合前的揮發油和最佳工藝下制備的包合物中提取出的揮發油各0.5 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加無水乙醇稀釋至刻度。再取包合物30 mg置于2 mL EP管用無水乙醇充分溶解,取上清液。參考《中國藥典》2020版一部,小茴香的鑒別方法,分別吸取上述樣品5 μL點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚—乙酸乙酯(17∶2.5)為展開劑,展開、取出、晾干,噴以5%二硝基苯肼溶液,日光至斑點顯現。

(3) 紅外光譜(IR)掃描:根據文獻[10]。取揮發油、β-環糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物適量,揮發油以溴化鉀涂片法制備樣品,其余采用溴化鉀壓片法制備樣品,于500～4 000 cm-1波數范圍進行紅外光譜掃描。

(4) 差示掃描量熱(DSC)分析:根據文獻[11]。稱取β-環糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物各5.0 mg,置于鋁制坩堝中,用差示掃描量熱儀進行分析。測定參數設置:氮氣體積流量40 mL/min,升溫速度10 ℃/min,升溫范圍30～480 ℃。

1.2.4 小茴香揮發油包合物穩定性研究

(1) 光穩定性試驗:分別稱取小茴香揮發油包合物各3份,每份5.0 g,密封于稱量瓶中,均照射10 d(強度4 000 lx),每隔5 d取樣測定包合率和反式茴香腦含量。

(2) 高溫試驗:分別稱取小茴香揮發油包合物各3份,每份5.0 g,用錫紙包封置于60 ℃恒溫干燥箱內放置10 d,每隔5 d取樣測定包合率和反式茴香腦含量。

(3) 高濕試驗:分別稱取小茴香揮發油包合物各3份,每份5.0 g,密封于稱量瓶中,每3份在25 ℃環境下,置于相對濕度分別為75%(飽和氯化鈉)和90%(飽和硝酸鉀)的2個密閉容器中放置10 d,每隔5 d取樣測定包合率和反式茴香腦含量。

1.3 數據處理

所有試驗均平行3次,以平均值±標準差表示,運用SPSS 20.0軟件對所得數據進行顯著性分析,利用Origin 2023軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小茴香揮發油成分分析

如圖1所示,小茴香揮發油經β-環糊精包合后,仍有清晰的反式茴香腦圖譜。經測定,小茴香揮發油中反式茴香腦含量為(79.16±1.04)%,包合物中反式茴香腦含量為(6.81±0.11)%。

A. 反式茴香腦標準品 B. 小茴香揮發油 C. 小茴香揮發油包合物

2.2 空白回收率試驗

通過3次平行試驗測定小茴香揮發油的空白回收率,得到小茴香揮發油的空白回收率為83%。

2.3 包合工藝優化

以綜合評分為指標對小茴香揮發油包合物制備工藝進行優化。由表2可知,對包合工藝影響程度大小順序為揮發油與β-環糊精比例>包合時間>包合溫度,最佳工藝條件為揮發油與β-環糊精比例1∶8 (mL/g),包合溫度40 ℃,包合時間60 min。

表2 小茴香揮發油包合物正交試驗評分結果

取小茴香揮發油1 mL,按最佳的包合工藝條件進行3次驗證實驗,測得小茴香揮發油平均包合率為(96.90±1.76)%,相對標準偏差(RSD)1.81%;包合產率為(93.61±0.62)%,RSD 0.67%;反式茴香腦含量為(6.81±0.11)%,RSD 1.62%,綜合評分為99.68,RSD<5%,該包合工藝穩定可行。

由表3可知,揮發油與β-環糊精比例及包合時間對包合率有顯著影響(P<0.05),可能是由于β-環糊精用量對包合產率的影響較大;包合時間長,使得揮發油能夠更加充分地進入β-環糊精內部,有利于包合物的形成。

表3 綜合評分方差分析表

2.4 小茴香揮發油包合物表征

2.4.1 掃描電鏡觀察 分別取β-環糊精、物理混合物和包合物適量,經導電膠粘樣、噴金鍍膜后,觀察其形貌特征。如圖2所示,β-環糊精為大分子的環狀低聚糖結構,在1 000放大倍數下,其質地松散,表面粗糙,β-環糊精的形態較大[11],而物理混合物是與揮發油的簡單混合物,因此與β-環糊精的形態差異不大。在2萬放大倍數下,物理混合物中小茴香揮發油呈小顆粒分散在β-環糊精的表面及四周,并未進入其內部。在包合物的制備中,由于在磁力攪拌的作用下揮發油小分子被打散進入到β-環糊精空腔內部使得其發生形態學變化。同時,在攪拌的過程中由大顆粒塊狀的β-環糊精細化成了小分子,并且分布均勻,呈棱狀。從圖2F可以明顯地看出,揮發油已進入β-環糊精分子內部,說明包合物的形成。

A. β-環糊精(1 000倍) B. 物理混合物(1 000倍) C. 包合物(1 000倍) D. β-環糊精(2萬倍) E. 物理混合物(2萬倍) F. 包合物(2萬倍)

2.4.2 薄層色譜分析 通過查閱文獻[12]發現茴香醛為小茴香揮發油中標識性成分,并在薄層中能很好顯現,故選擇茴香醛作為對照品。如圖3所示,從藥材中提取得到的小茴香揮發油成分,與從包合物中提取得到的揮發油成分一致。包合物在薄層色譜與茴香醛相對應的斑點并未顯示,說明揮發油已被包合在β-環糊精中[13]。

A. 小茴香揮發油 B. β-環糊精 C. 物理混合物 D. 包合物

2.4.4 差示掃描量熱分析 由圖5可知,β-環糊精在140 ℃的特征吸收峰是由于樣品表面的小分子水、內部結晶水和小分子物質的分解,310 ℃的熔融峰是由于β-環糊精的主鏈及交聯鍵的斷裂,350 ℃左右為β-環糊精的分解峰[16],主要為碳殘余的降解;在物理混合物中同樣能夠明顯地看到在140,310,350 ℃左右仍存在β-環糊精空腔中結晶水蒸發的吸熱峰、β-環糊精的熔融峰和分解峰,說明物理混合物的結構與β-環糊精的十分相似。但包合物在140 ℃左右出現的吸熱峰并不明顯,可能是由于包合在β-環糊精空腔中的揮發油將結晶水置換出來[17],推測形成了包合物。在310,350 ℃的吸收峰也較為平緩,是由于在形成包合物后β-環糊精的熱穩定性提高。包合物與物理混合物呈現出不同的吸熱狀態,表明包合物形成[18],與掃描電鏡和紅外光譜分析的結果一致。

2.5 小茴香揮發油包合物穩定性

2.5.1 光穩定性試驗 由表4可知,在連續光照5 d后,包合物的外觀性狀,包合率和反式茴香腦含量基本保持不變,光照10 d后包合率和反式茴香腦含量發生較小變化,光照對包合物的影響較小[19]。

表4 包合物光照試驗結果

2.5.2 高溫試驗 由表5可知,包合物經高溫試驗后,其外觀發生明顯變化,由原本白色粉末變成微黃色,并且出現質量減少的現象。在高溫下,由于揮發油的揮發性會從β-環糊精的空腔中溢出,使得包合物重量減輕,出現揮發油似的淡黃色,說明包合物中的揮發油在高溫烘烤下會從內部釋放,也說明揮發油進入到β-環糊精內部。隨著高溫時間的延長,包合率及反式茴香腦含量相較于前5 d降低速率減慢,表明包合物具有一定的高溫耐受力。但是為了保證揮發油包合物的穩定性以及反式茴香腦含量的穩定,應避免將包合物置于高溫下[20]。

表5 包合物高溫試驗結果

2.5.3 高濕試驗 由表6可知,相對濕度為75%時,第5天包合物外觀性狀變化不太明顯,第10天外緣開始潮解,呈結塊狀,吸濕性增加,包合率和反式茴香腦含量均有所降低。而相對濕度為90%時,第5天包合物就出現明顯的結塊和粘壁現象,其包合率和反式茴香腦含量也明顯降低;第10天包合物出現吸濕溶解現象,呈黏稠狀,包合率和反式茴香腦含量顯著降低。說明75%濕度下揮發油的包合率和包合物中反式茴香腦含量變化不大,在90%的濕度下對揮發油包合率和包合物中反式茴香腦含量的影響較大,表明常溫干燥環境有利于小茴香揮發油包合物的穩定[21]。

表6 包合物高濕試驗結果

3 結論

研究采用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮發油,通過高效液相色譜法測定小茴香包合物中反式茴香腦含量。以β-環糊精為包合材料,以包合率、反式茴香腦含量、包合產率為指標,由正交試驗優化得到揮發油與β-環糊精比例1∶8 (mL/g),包合溫度40 ℃,包合時間60 min,在此工藝條件下的包合率為96.90%,包合產率為93.61%,反式茴香腦含量為6.81%,綜合評分99.68。該包合工藝操作簡便。掃描電鏡觀察、紅外光譜分析、差示掃描量熱分析和薄層色譜分析發現,揮發油已成功包合進β-環糊精中,并形成了包合物。穩定性試驗表明,小茴香揮發油β-環糊精包合物宜貯藏在常溫干燥密封的環境下。后續可將小茴香揮發油包合物作為保鮮劑、抗菌劑、制劑原料等應用于食品、藥品中,研究小茴香揮發油包合物中有效成分是否發揮功效作用。