基于轉錄組測序分析葡萄籽原花青素對HepG2細胞基因及其相關功能的影響

鄭萬財

黨 斌1,2

張 跡3

羅巧玉4

馮作山5

(1. 青海大學農林科學院青藏高原種質資源研究與利用實驗室,青海 西寧 810023;2. 青海省青藏高原農產品加工重點實驗室,青海 西寧 810023;3. 淮陰師范學院生命科學學院,江蘇 淮安 223300;4. 青海師范大學生命科學學院,青海 西寧 810023;5. 新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊 830000)

近年來,對植物中的活性成分的分析成為研究熱點。其中,原花青素(procyanidins,PCs)作為一類重要的植物次生代謝產物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[1-5]。然而,原花青素對人體細胞的影響及其相關功能尚不完全清楚。原花青素是植物中廣泛存在的酚類化合物[6-8],主要被應用于保健食品、功能性食品和生物醫藥等方面的開發利用[9-11]。目前,HepG2細胞作為人類肝癌細胞系,在肝癌研究中被廣泛應用。通過研究原花青素對HepG2細胞的影響,可以探索其對肝癌的潛在治療作用。然而,有關原花青素對HepG2細胞及其相關功能的影響機制還存在許多未知之處[12-15]。中國肝癌發病總數占全球肝癌病人總數的50%,已成為影響人們生命健康的主要疾病[16]。化學療法是肝癌中最常用的治療方法,由于癌細胞的劑量限制和耐藥性,化學藥物不能完全有效地治療癌癥[17]。

研究擬采用轉錄組測序(RNA-Seq)技術[18-20],通過分析HepG2細胞在原花青素處理前后的基因表達差異,來鑒定潛在的關鍵基因和通路。利用RNA-Seq技術研究葡萄籽原花青素對HepG2細胞的作用機制,為進一步研究其在肝癌治療中的應用提供依據。同時,也有助于拓展對原花青素的認識,并為開發植物活性成分的藥物提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽原花青素:原花青素質量分數>95%,四川省維克奇生物科技有限公司;

RPMI 1640培養基、胎牛血清:美國Corning公司;

HepG2細胞:北京中科院生物化學和細胞生物學研究所;

Real-time試劑盒:美國BIO-RAD公司;

瓊脂糖:荷蘭Duchefa Biochemie公司;

Trizol:美國Ambion公司。

1.2 儀器與設備

分析天平:BT25S型,北京賽多利斯儀器系統有限公司;

真空冷凍干燥機:FD-1A-50型,德國Christ公司;

臺式高速冷凍離心機:5810R型,德國Eppendorf公司;

PCR擴增儀:T100 Thermal型,德國Eppendorf公司;

酶標儀:Infinite M200 Pro型,瑞士Tecan公司;

超微量紫外可見光分光光度計:NanoDrop One型,美國Thermo公司;

二氧化碳培養箱:HERACELL I50i型,日本SANYO公司;

PCR電泳槽:Power PacTMHC型,美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養及處理 取對數生長期人肝癌HepG2細胞于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養,每3 d傳代1次,當細胞貼壁達到70%時,以體積分數為0.25%的胰酶消化傳代。預試驗采用不同質量濃度的原花青素(5,10,15,20,25 g/mL)處理HepG2細胞24,48 h,以確認后續轉錄組處理的原花青素最適質量濃度及時間。選取50 μg/mL的蝦青素添加到HepG2細胞中,處理48 h;另添加等量1%的DMSO作為溶劑對照組。

1.3.2 RNA提取和質量檢測 采用Trizol試劑法[21]提取總RNA,每組3個重復。利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度;提取樣本的總RNA后,通過常規試劑盒去除rRNA,將mRNA富集。進一步將富集得到的mRNA反轉錄形成雙鏈cDNA,修復cDNA雙末端后,加上接頭,PCR擴增構建上機文庫。通過帶有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后,用超聲波將mRNA打斷。以片段化的mRNA為模板,隨機寡核苷酸為引物,在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,隨后用RNaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I 體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭,用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA,進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物,最終獲得文庫。為保證測序質量,采用嚴格的質控構建文庫。

1.3.3 轉錄組測序和差異基因分析 由廣州基迪奧生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 4000system平臺進行轉錄組測序。對測序得到的原始序列(raw reads)進行過濾,去除接頭序列、重復冗余序列和低質量的reads,得到高質量序列(clean reads)。利用HISAT2[22]軟件開展基于參考基因組的比對分析。根據HISAT2的比對結果,利用Stringtie重構轉錄本,并計算每個樣本中所有基因的表達量。基于基因表達量信息,利用R(http://www.r-project.org/)開展主成分分析(PCA),基因差異表達分析的數據為基因表達水平分析中得到的reads count數據,使用DESeq2[23]軟件分析篩選差異表達基因,差異倍數篩選FDR<0.05 且 |log2FC|>1的基因為顯著差異基因。

利用GO和KEGG數據庫對差異表達基因進行功能注釋,并采用FPKM值反映基因的表達量。

1.4 數據處理

利用IBM SPSS Statistics 22軟件、計算機軟件R(版本3.5.0)、Excel對數據進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組數據分析

由表1可知,最小Q20值為98.04%,最小Q30值為94.31%,說明獲得的clean reads質量較高,重復性在誤差范圍內,完全滿足后續生物學及相關分析的要求。

表1 數據質量和參考序列比對分析結果?

由圖1可知,Control組和PCs組各自聚為一類,且Control組的重復性較好。每兩個樣品之間的皮爾斯(Pearson)相關系數均>0.99,說明同一處理組樣品間差異較少,組內穩定性較好;不同組樣品間的相關性均>0.90,不同處理組之間差異表達基因較少,說明不同組之間差異較小。

圖1 葡萄原花青素對HepG2細胞轉錄組主成分和相關系數分析

2.2 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組差異表達基因分析

原花青素處理細胞后,通過兩組轉錄本對比,對基因表達進行層次聚類分析(圖2、圖3),并篩選差異基因(表達倍數差異log2FC>2,顯著性P-value<0.05)結果顯示,共有2 554個差異基因,其中有887個上調基因和1 667個下調基因。由圖4、圖5可知,在PCs的作用下,細胞HepG2差異表達基因表達上調與表達下調的數量相比,下調的基因數高于上調的。原花青素的生物活性主要是清除自由基抗氧化,原花青素通過抑制細胞生長增殖、誘導細胞程序性凋亡、調節核因子NF-κB的活性、阻滯細胞周期、抑制目標基因的表達等達到其抗癌作用[24]。課題組[25]前期研究表明:小劑量PCs(50 μg/mL)即能誘導HepG2細胞凋亡,與空白對照相比差異極顯著(P<0.01),且PCs對HepG2細胞增殖的抑制作用具有時間和濃度依賴關系。通過兩組樣本中差異表達基因分析,原花青素可明顯抑制HepG細胞中基因的轉錄水平。

深灰色代表上調基因;淺灰色代表下調基因;白色代表基因無顯著差異

圖3 差異表達基因統計

圖4 HepG2細胞葡萄籽原花青素處理條件下的差異基因表達火山圖

A1. 細胞 A2. 細胞部分 A3. 細胞器 A4. 細胞器部分 A5. 大分子復合物 A6. 膜封閉腔 A7. 膜 A8. 細胞外區域 A9. 細胞外區域部分 A10. 細胞外基質 B1. 結合 B2. 催化活性 B3. 核酸結合轉錄因子活性 B4. 轉運活性 B5. 分子功能調節 B6. 結構分子活性 B7. 轉錄因子活性 C1. 細胞過程 C2. 單一生物過程 C3. 代謝過程 C4. 應激效應 C5. 生物調節 C6. 細胞組分組織或合成 C7. 發育進程 C8. 信號轉導 C9. 胞質定位 C10. 生物調控過程 C11. 免疫系統過程 C12. 多細胞組織過程 C13. 運動調節 C14. 生物黏附 C15. 繁殖調節 C16. 生長調節 C17. 多組織過程

2.3 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組GO功能分析

對葡萄籽原花青素處理的HepG2細胞轉錄組數據進行差異表達基因GO功能富集分析。每組差異基因被注釋到生物學過程、分子功能、細胞組分和3個GO分類中(圖5),2 279個差異基因富集到166個分子功能通路中,具有顯著差異的通路依次為細胞過程、單一生物過程、代謝過程、刺激反應、生物調節、細胞組分組織或合成、發育進程、信號轉導、胞質定位、生物調控過程、免疫系統過程、多細胞組織過程、運動調節、生物黏附、繁殖調節、生長調節、多組織過程。2 286個差異基因富集到62個分子功能通路中,具有顯著差異的通路依次為結合、催化活性、核酸結合轉錄因子活性、轉運活性、分子功能調節、結構分子活性、轉錄因子活性。2 400個差異基因富集到60個細胞組分通路中,具有顯著差異的通路依次為細胞、細胞部分、細胞器、細胞器部分、大分子復合物、膜封閉腔、膜、細胞外區域、細胞外區域部分、細胞外基質。

葡萄籽原花青素處理后主要富集到的生物學過程為細胞過程、代謝過程、生物調控過程、免疫系統過程、繁殖調節、生長調節,符合原花青素在肝癌細胞上的作用機制[26]。杜宏等[27]研究發現,蓮房原花青素可誘導肝癌細胞凋亡,抑制其生長且呈濃度依賴性,通過對肝癌細胞周期比率分析顯示,蓮房原花青素具有抑制肝癌細胞DNA合成,阻滯其增殖的作用。梁惠敏等[28]研究發現,原花青素可抑制肝癌細胞的生長,且濃度和時間呈劑量關系,原花青素對肝癌細胞SMMC27721具有抑制增殖和促進肝癌細胞分化作用,進一步研究發現,原花青素通過清除活性氧酶活降低脂質過氧化反應抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。許慧等[29]研究發現,蓮房原花青素可降低肝癌細胞合成DNA的能力,使其停滯于S期,繼而抑制細胞的生長介導其凋亡。綜上,原花青素通過抑制細胞生長,清除氧自由基,對癌細胞DNA合成具有抑制作用,可以阻滯細胞增殖,導致細胞凋亡。

2.4 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組KEGG Pathway富集分析

葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組的KEGG通路富集分析,共有1 016個基因富集到322條代謝通路(圖6、圖7),差異基因主要被聚類到六大途徑:基礎代謝過程、生物系統、人類疾病、細胞過程、基因信息過程和環境信息過程?；A代謝過程包括外源化合物的生物降解與代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、碳水化合物代謝和核苷酸代謝等;生物系統包括免疫系統、內分泌系統、神經系統和消化系統等;人類疾病包括傳染性疾病、癌癥、內分泌和代謝疾病、心血管疾病、神經衰退行性疾病和免疫疾病等;細胞過程包括細胞凋亡、運輸與分解代謝和細胞運動等;基因信息過程主要包括基因復制、修復、翻譯、折疊、轉錄和降解等;環境信息過程包括信號轉導、信號分子與相互作用、膜運輸。如圖7所示,細胞凋亡相關的信號傳導途徑包括TNF信號通路、p53信號傳導途徑被顯著地富集。這兩個途徑類別中的差異表達基因可能與原花青素處理引起的細胞凋亡密切相關,突顯出葡萄籽原花青素在抑制HepG2細胞的作用,與TNF信號通路、p53信號傳導途徑相關的信號通路有PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路均與細胞凋亡密切相關。

A. 基礎代謝過程 A1. 外源化合物的生物降解與代謝 A2. 氨基酸代謝 A3. 脂質代謝 A4. 碳水化合物代謝 A5. 核苷酸代謝 A6. 輔因子和維生素代謝 A7. 其他氨基酸的代謝 A8. 多糖合成和代謝 A9. 外源生物的生物降解與代謝 A10. 能量代謝 A11. 其他次生代謝生物的生物合成 A12. 萜類和聚酮類代謝 B. 生物系統 B1. 免疫系統 B2. 內分泌系統 B3. 神經系統 B4. 消化系統 B5. 發育 B6. 環境適應 B7. 血液循環系統 B8. 感官系統 B9. 排泄系統 B10. 老化 C. 人類疾病 C1. 傳染性疾病 C2. 癌癥 C3. 內分泌 C4. 代謝疾病 C5. 心血管疾病 C6. 神經衰退性疾病 C7. 免疫疾病 C8. 抗藥性 D. 細胞過程 D1. 細胞凋亡 D2. 運輸與分解代謝 D3. 真核細胞群落 D4. 細胞運動 E. 基因信息過程 E1. 基因復制和修復 E2. 翻譯 E3. 折疊和轉錄 E4. 降解 F. 環境信息過程 F1. 信號轉導 F2. 信號分子與相互作用 F3. 膜運輸

1. DNA復制 2. 細胞周期 3. 同源重組 4. 范可尼貧血信號通路 5. 失配修正 6. 堿基切除修復 7. 代謝途徑 8. 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝 9. 過氧化物酶體 10. 真核生物核糖體的生物發生 11. 流體剪切應力與動脈粥樣硬化 12. 為嘧啶代謝 13. TNF信號通路 14. 二羧酸代謝 15. 膽固醇代謝 16. p53信號通路 17. TGF-β信號通路 18. 膀胱癌 19. 核苷酸切除修復 20. 脂肪酸降解 21. 精氨酸和脯氨酸代謝 22. 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝 23. 白細胞經外周遷移 24. 精氨酸生物合成 25. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解

通過細胞凋亡相關差異基因篩選出5條與細胞凋亡相關的通路,包括NF-κB信號通路、MAPK通路、TNF信號通路、p53信號傳導途徑和PI3K/Akt信號通路,NF-κB是基因表達的重要調控因子之一。Maldonado等[30]研究發現,原花青素通過NF-κB和p53上調細胞凋亡相關受體的表達與其誘導的癌細胞凋亡具有一定的相關性。盧婷婷等[31]研究發現,用熒光素酶表達載體PGL3質粒轉染A549細胞,原花青素對COX-2啟動子活性有明顯抑制作用。Engelbrecht等[32]研究發現,原花青素處理后Caco細胞無明顯變化,而NCM460細胞隨原花青素濃度的增大,其細胞抑制率也增大,通過蛋白印跡試驗,原花青素使PI3K/Akt的催化亞基(P110)和調節亞基(P85)出現衰減,使PKB-SER473的磷酸化減弱,細胞出現程序性死亡。據報道[33-34],絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路參與細胞內炎癥信號的級聯,與促炎細胞因子和NF-κB轉錄激活密切相關,并參與增殖、分化、轉化和凋亡等一系列生物學過程。綜上,原花青素通過抑制HepG2細胞相關基因的表達和通路的活化,誘導HepG2細胞發生凋亡。

2.5 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉錄組信號通路及差異基因表達分析

對兩組差異代謝通路對比分析(表2),細胞凋亡通路相關的差異基因24個,與TNF信號通路相關的差異基因28個,p53信號通路相關的差異基因18個,MAPK信號通路相關的差異基因47個,PI3K-Akt信號通路相關的差異基因51個,NF-κB信號通路相關的差異基因18個。

表2 差異基因與細胞凋亡相關的KEGG途徑

結合GO和KEGG富集結果,與細胞凋亡相關的差異基因有24個(表3),12個關鍵差異基因中,上調基因有9個,下調基因有3個。細胞凋亡12個關鍵差異基因與TNF、p53、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB信號通路密切相關,其中,與TNF信號通路相關差異基因有9個,與p53信號通路相關的差異基因有2個,與MAPK信號通路相關差異基因有6個,與PI3K-Akt信號通路相關差異基因有2個,與NF-κB信號通路相關差異基因有6個。

表3 原花青素對HepG2細胞差異基因及差異表達水平分析

葡萄籽原花青素對HepG2細胞的轉錄組信號通路產生了明顯影響,尤其在細胞凋亡過程中起到了重要的調控作用。差異基因與多個信號通路的調控相互交織,共同參與了細胞凋亡的調控過程。

3 結論

葡萄籽花青素處理HepG2細胞后,其主要富集到的生物學過程為細胞過程、代謝過程、生物調控過程、免疫系統過程、繁殖調節和生長調節。通過KEGG pathway分析,葡萄籽花青素處理HepG2細胞后的基因差異表達水平涉及到細胞凋亡和多個信號通路的調控。12個關鍵差異基因與相關通路結果表明,細胞凋亡與TNF信號通路、p53信號傳導途徑、PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路及MAPK信號通路密切相關。葡萄籽花青素通過調節這些信號通路的活性,可能在細胞中誘導細胞凋亡,從而抑制細胞進一步生長和擴散。后續可以重點關注差異基因在信號通路中的具體作用和相互調控關系,以深入揭示葡萄原花青素在肝癌細胞中的作用機制。