網絡藥理學結合分子對接技術揭示芹菜籽抑制痛風的潛在分子機制

李鎂娟

張 軍2

張云數2

李乾偉2

張 娜2

劉夢嬌2

張人平2

(1. 河南國德標檢測技術有限公司,河南 鄭州 451100;2. 鄭州工程技術學院化學與食品工程學院,河南 鄭州 450044)

近年來,隨著物質生活水平的日益提高和生活方式的改變等因素的影響,代謝性疾病已經成為全球亞健康狀態的主要原因[1]。代謝性疾病是指因生物體自身代謝引起的疾病,包括代謝減少或合成旺盛等,包括糖尿病、血糖紊亂癥、高尿酸癥等[2],高尿酸癥已成為繼高血糖、高血壓、高血脂后的“第四高”[3]。高尿酸癥可以引起高血壓[4]和一系列血管疾病[5],更是痛風形成的直接誘因[6]。痛風是人體嘌呤合成代謝增加,尿酸產生過多或排泄不暢而致血中尿酸濃度升高,尿酸鹽呈針狀結晶沉積在關節滑膜、腎臟及其他組織中引起的一種代謝炎性疾病[7]。痛風在一般人群中的患病率為1%～4%,男性比女性患病風險多2～6倍,全球痛風發病率仍有增加之勢[8]。痛風常用藥物秋水仙堿、別嘌呤醇、非布司他等都有一定的副作用而不能長期使用[9]。因此,尋找無副作用的藥物,或開發新的治療方法成為解決痛風等代謝性疾病的關鍵。

Downer等[10]認為,代謝引起的疾病最好用飲食方法來解決,即“食品就是藥品”。中國自古就有“藥食同源”之說,用食物治療或減輕疾病是中國中醫藥最偉大的思想之一[11-12]。芹菜(ApiumgraveolensL.)是二年或多年生草本類植物,香氣濃郁,是深受消費者喜愛的菜蔬之一,自古就有芹菜籽(種子)作為調料食用或中藥使用。實踐[13-15]表明,芹菜籽對抑制痛風的發生,緩解癥狀有一定效果,但芹菜籽對痛風的抑制機理仍不清晰。

隨著生物信息學和系統生物學的快速發展,網絡藥理學方法已被完美地用于尋找關鍵靶點及其潛在的分子機制[16]。基于“藥物—疾病—靶點”相互作用網絡的網絡藥理學,全面、系統地評價藥物對疾病的干預效果,符合中醫學的特點;分子對接是一種重要的計算機輔助藥物發現方法,可用于預測藥物成分與靶蛋白之間的相互作用,以及藥物可能的結合位點[17],這為藥物發現或疾病治療機理提供了重要思路和方法。研究使用網絡藥理學預測芹菜籽治療痛風的潛在機理、用分子對接技術驗證分子機制,為治療或預防痛風開發新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 芹菜籽關鍵成分篩選及靶點基因提取

從已有能查到文獻[14-15,18-19]中篩選芹菜籽的成分共計74種,再使用化源網(https://www.chemsrc.com)查詢其CAS號,使用中藥系統藥理學分析平臺數據庫(https://www.tcmsp-e.com,TCMSP)以查找CAS號的方式來查找芹菜籽的關鍵成分,并且以類藥性(DL)≥0.10,口服生物利用度(OB)≥20%為篩選條件,篩選出具有藥物性質且人類腸道易于吸收的成分,經由TCMSP數據庫篩選得芹菜籽核心活性分子作用靶點;借助UniProt資料庫(http://www.uniprot.org)查詢并確立相應靶蛋白歸屬的規范化基因名,經過去除冗余后,精準鎖定芹菜籽主要成分的靶向基因。

1.2 痛風疾病相關靶點的搜集

檢索孟德爾人類遺傳學數據庫(https://omim.org/,OMIM)和人類基因數據庫(https://www.genecards.org,GeneCards),搜索“gout”,刪除重復項,獲得痛風疾病所有的靶點基因。將芹菜籽的關鍵成分的靶點基因與痛風疾病的靶點基因導入https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/網站繪制韋恩圖,獲得芹菜籽與痛風的交集靶點基因以及數量。

1.3 芹菜籽活性成分—痛風靶點網絡構建及可視化分析

通過Cytoscape 3.9.0軟件收集芹菜籽活性物質與痛風相關基因的數據,構筑了一幅涵蓋“分子—疾病靶點”復雜網絡圖。隨后,運用該軟件的Network Analyzer工具,對圖中的多個節點進行了精確的拓撲屬性評估。特別關注的是節點的中介中心性(BC)、緊密中心性(CC)以及度中心性(DC)三項指標。它們的平均值超過特定閾值的節點,即為在芹菜籽對痛風治療中發揮核心作用的關鍵活性成分。

1.4 蛋白互作網絡(PPI網絡)的構建

輸入芹菜籽與痛風相關基因的交互數據,轉至String數據庫(https://www.string-db.org),選擇“Multiple proteins”作為搜索維度,將種屬鎖定為“Homo sapiens”,并設定置信度閾值不低于0.9。為清晰可視化,屏蔽掉所有斷裂節點,之后將信息以tsv格式導出。并將該文件納入Cytoscape 3.9.0軟件中,借助CytoNCA插件進行深入的網絡拓撲分析。通過綜合比較6個核心參數——中介中心性、緊密中心性、度中心性、特征向量中心性(EC)、局部邊連通性(LAC)以及網絡中心性(NC)的平均值,從中篩選出具有代表性的網絡關鍵節點,即為核心靶向基因。

1.5 GO功能和 KEGG通路富集分析

采用 DAVID 6.8 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),對芹菜籽潛在治療痛風靶點進行GO功能分析,以了解靶點的生物學過程,KEGG通路分析研究藥物靶點主要信號通路,DAVID平臺列表與背景均設置為“Homo sapiens”,GO富集分析選擇生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)3個模塊,通路分析選擇KEGG。將GO分析的BP、CC、MF通路分析的數據下載保存好,然后按照P值從小到大排序,KEGG通路富集分析靶點信號通路,以P<0.05為閾值,依據count值進行排序。再選取前20條信號通路對BP、CC、MF和KEGG通路分析的重要通路,使用微生信在線網(http://www.bioinformatics.com.cn/)作帶顏色富集條形圖進行可視化分析。

1.6 分子對接過程

利用軟件Chemdraw畫出篩選的芹菜籽成分的2D結構,再使用Chem3D軟件將2D結構轉換為3D結構,優化力學結構,使其結構處于穩定狀態,從蛋白質數據庫(PDB)中提取針對痛風疾病相關的靶蛋白的三維構象文件。通過PyMOL軟件的精確操作,排除了水分子及非必要的小分子配體,僅留下純凈的受體蛋白結構并保存為標準的.pdb文件。隨后,借助AutoDock 1.2.0軟件對該蛋白受體進行精細化處理,包括加氫和調整分子的柔韌性。同時,對小分子配體也執行了加氫處理,并精確識別了配體的活性中心。經過一系列的預處理后,將蛋白受體與配體統一轉換為.pdbqt格式,并利用Grid模塊仔細設定對接盒子的參數,力求將其體積最小化以精準覆蓋蛋白結構,確保空間定位的高效率和精確性。參數設置完畢后,保存配置,并運用AutoDock軟件進行配體與受體的分子對接工作,從而計算出結合能(BE)的分值。此過程不僅體現了對分子生物學深刻的理解,也展現了計算化學在藥物設計中的實際應用。

2 結果與分析

2.1 芹菜籽關鍵成分的篩選結果

芹菜籽主要活性成分為黃酮化合物、烯萜類成分等。利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)檢索到芹菜籽主要活性成分除洋川芎內酯-N、洋川芎內酯-J、木栓酮、佛手苷內酯、β-芹子烯外均有對應靶點,總計375個,刪除重復項,相關主要活性成分16種,對應202個活性成分靶點。芹菜籽主要活性成分信息見表1。

表1 芹菜籽的活性成分

由于TCMSP篩選有效成分多依據DL和OB,設置較高會使本來有效果的成分無法進行全面分析,因此,將OB≥20%,DL≥0.10[20],所得有效成分16種。

2.2 “芹菜籽成分—痛風靶點”篩選

通過GeneCards共獲得芹菜籽核心成分的靶點基因共202個;使用OMIM database篩選痛風對應的靶點基因,刪除重復項后共1 732個。其中芹菜籽與痛風疾病交集靶點基因合計69個,見圖1。

圖1 芹菜籽藥效成分靶點與痛風相關靶點的韋恩圖

2.3 “芹菜籽成分—痛風靶點”網絡構建及可視化分析

利用Cytoscape 3.9.0軟件建立藥物——活性成分—靶點—疾病的可視化網絡圖,再利用Cytoscape 3.9.0軟件的Analyze Network功能,對交集靶點基因進行評分(0～1分有38個基因,為一類評分;2～3分有22個基因,為二類評分;4～8分有9個基因,為三類評分),一類基因在最外層,二類基因放在第二層,三類基因放在最內層。在建立芹菜籽核心成分與痛風疾病的網絡圖時,發現芹菜籽有5個成分所對應的靶點基因與痛風疾病靶點基因沒有聯系,即這5個成分對治療痛風疾病并沒有效果,因此在繪制網絡圖時不納入。通過評分得到10種關鍵成分,“芹菜籽成分—痛風靶點”網絡詳見圖2。成分節點的大小表示與其相關的靶點基因數量多少,藍色菱形越大表示與之相關聯的基因數量越多,在網絡中作用也就越明顯。

菱形代表芹菜籽的關鍵成分,橢圓形代表“芹菜籽—痛風”交集靶點基因

使用Cytoscape 3.9.0軟件的Network Analyer插件對上述網絡中的藍色藥物節點進行拓撲分析得出,芹菜籽核心靶點網絡節點平均BC值為0.217 5,平均CC值為0.456 7,平均DC值為13.6。其中只有槲皮素1種成分的BC值、CC值、DC值均大于芹菜籽核心靶點網絡節點平均值(槲皮素BC 0.723 814 1,CC 0.685 185 19,DC 63),推測其可能是芹菜籽治療痛風的重要成分。

2.4 PPI網絡結果分析

將芹菜籽與痛風的交集基因導入String在線平臺對69個潛在靶點進行PPI蛋白互作網絡分析。如圖3所示,網絡中包含69個節點,115條邊,平均節點度為3.33,平均局部聚類系數0.475。

圖3 PPI網絡與關鍵靶點

靶點連接的線越多,表明該靶點DC值越高,越是關鍵靶點,按照DC值≥10篩選條件[21],獲得10個核心靶點基因,分別為絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、血小板衍生的生長因子受體β(PDGFRβ)、酪氨酸蛋白激酶(LYN)、白細胞介素-4(IL4)、酪氨酸蛋白激酶HCK(HCK)、白細胞介素-8(CXCL8)、整合素αV(ITGAV)、白細胞介素-2(IL2),以上10種靶點基因拓撲參數 BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自均值121.033 02,0.148 69,7.392 86,0.085 02,2.216 19,3.122 07,詳見表2。

表2 核心靶點基因拓撲參數

通過建立芹菜籽成分—痛風基因靶點網絡,發現10個藥物成分中,有5個成分與核心基因靶點密切相關,推測這5個藥物成分是治療痛風疾病的關鍵成分,即核心成分:槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素,在網絡中DC值分別是63,28,25,7,5,詳細情況見圖4。

圖4 芹菜籽核心成分—痛風關鍵基因靶點網絡

2.5 分子對接驗證分析

將2.4得到的5個核心成分為配體與痛風關鍵基因TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRB、HCK、VEGFA、ITGA、IL2為受體進行分子對接進行驗證。對接RMSD<0.2 nm,分子對接結合能見表3。如果分子對接結合能<0 kJ/mol時,表明小分子配體可以與蛋白受體結合;結合能<-17.7 kJ/mol,表明可以自發地結合;結合能<-29.3 kJ/mol,說明分子間具有很強的結合活性[22-23]。結合能越小,說明配體與蛋白之間親和力越大,兩者發生相互作用的可能性越高,進而發揮作用越大[24]。

表3 核心成分與靶點基因蛋白的分子對接結合能

由表3中數據可知,5個核心成分與痛風關鍵基因平均結合能<-17.7 kJ/mol,表明活性成分與核心靶點之間可以自由結合,槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素與關鍵基因平均結合能<-29.3 kJ/mol,表明其與核心靶點之間有強烈的結合力。因此,認為分子對接預測結果真實可靠,PyMol軟件可以對每個小分子配體與疾病靶點蛋白結合能最低的分子對接結果進行可視化調節,如圖5所示。

圖5 分子對接模式圖

由對接結果可知氫鍵是促進芹菜籽主要成分和與痛風關鍵基因活性位點結合的主要作用力。即槲皮素-HCK結合的活性位點ALA-293、THR-338、MET-341形成3個氫鍵;芹菜素-HCK編碼蛋白的活性位點THR-338、MET-341形成2個氫鍵;木犀草素-ITGAV的活性位點VAL-23、VAL-98、ARG-99、PHE-278、TYR-406形成5個氫鍵;柯伊利素-LYN的活性位點ASP-156、ILE-86、LYS-44、MET-91、GLU-89 形成5個氫鍵;芹菜甲素-HCK的活性位點THR-338形成1個氫鍵。從對接結果來看,配體—受體形成氫鍵越多,復合體系越穩定,對蛋白質的活性控制能力就越強[25-26]。因此,木犀草素、柯伊利素對痛風的抑制效果較強。

2.6 GO功能富集和KEGG信號通路分析

將獲得的69個芹菜籽抗痛風的潛在靶點基因導入DAVID數據庫,限定物種為“Homo Sapiens”,以P<0.05為篩選條件,進行GO功能富集和KEGG分析[27],結果如圖6所示。GO富集得到463個條目,其中BP 349個,CC 39個,MF 75個。BP主要是細胞凋亡過程的負調控(negative regulation of apoptotic process)、正向調控細胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、細胞遷移的正向調節(positive regulation of cell migration)等;CC主要是細胞外間隙(extracellular space)、胞外區(extracellular region)、細胞表面(cell surface)等;MF主要是酶結合(enzyme binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、蛋白質同源二聚活性(protein homodimerization activity)等。

圖6 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到1 225條目,以P<0.05為閾值,依據count值排序,選取前20條KEGG信號通路上的基因作為痛風治療靶基因。由于研究的是芹菜籽抗痛風作用,因此在得到的前20條通路中去掉與之無關的通路,得到PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(fluid shearstress and atherosclerosis)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等。按照打分排列前10的通路見表4。

表4 通過KEGG通路富集的前10條通路

3 結論

綜上所述,研究應用網絡藥理學方法預測了芹菜籽藥效成分及作用靶點,其中抑制或治療痛風關鍵成分為槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素和芹菜甲素,與痛風相關的靶點TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRβ、HCK、VEGFA、ITGA、IL2密切相關。使用分子對接技術將芹菜籽活性成分與關鍵靶點進行結合能力預測,發現槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素與10種蛋白均具有良好的結合活性,結合能均小于-20.97 kJ/mol,驗證了芹菜籽中多種有效成分通過作用于關鍵靶點起到防治痛風的作用,其中柯伊利素與10種關鍵靶點蛋白結合能最低,為-33.76 kJ/mol,表明具有強烈的結合活性。GO 功能富集分析表明芹菜籽具有調控細胞凋亡,影響炎癥反應的作用。KEGG 富集分析發現,芹菜籽活性成分與痛風靶標之間相互作用的主要信號通路可能是PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等,表明芹菜籽通過多條通路作用于痛風的調控過程。