QuEChERs方法結合SERS技術檢測豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留

楊海帆

丁 莉2

徐妙文1

沈 康1

王煦博1

(1. 揚州大學醫學院,江蘇 揚州 225001;2. 揚州大學附屬醫院,江蘇 揚州 225001)

硫酸慶大霉素和硫酸新霉素是眾多氨基糖苷類抗生素家族中的一員,具有廣譜的抗菌作用[1-2],在畜牧業中常與硫酸結合使用[3-4]。盡管目前養殖業更多使用毒性較小的抗生素,但氨基糖苷類抗生素因低成本和高效的優勢仍被廣泛應用于禽畜疾病的預防和治療,然而長期使用可能會導致動物組織中抗生素殘留。人類長期攝入抗生素含量超標的食物不僅會誘導細菌產生耐藥性[5],甚至會導致過敏反應、耳毒性和腎毒性[6]。GB 31650—2019規定牛、豬肌肉組織中慶大霉素和新霉素的最大殘留限量分別為100,500 mg/kg。目前,氨基糖苷類抗生素的檢測方法主要有液相色譜法[7]、液相色譜串聯質譜法[8]、免疫層析法[1,9]和酶聯免疫吸附分析法等[10-12]。色譜法和免疫層析法的靈敏度高,但耗時、成本高,難以實現現場化、快速化和規?；瘷z測;而酶聯免疫吸附分析法易發生交叉反應,其假陽性率高。

表面增強拉曼散射(SERS)是一種快速、無損、不受水分干擾的檢測方法,結合拉曼光譜與表面材料技術,利用局域表面等離子體共振(LSPR)和化學吸附的方法使得SERS信號顯著提升,高靈敏地檢測低濃度分析物[13-14]。當檢測某些超低濃度的殘留物時,納米材料產生的SERS增強十分關鍵。金納米花(AuNFs)具有粗糙的表面和許多分支,在材料表面形成大量的“熱點”,為待測分子提供特殊的吸附位點,從而顯著增強SERS效應[15]。因此,AuNFs被廣泛用作SERS活性基底的制備。PP合成紙是一種典型的疏水材料,可使納米顆粒在其表面聚集,增強SERS效應。有研究[16]表明,采用還原氧化石墨烯—金復合納米材料檢測氧氟沙星,檢測限為0.3 ng/mL。Wattanavichean等[17]以銀納米棒作為基底檢測恩諾沙星、土霉素和新霉素,檢測限分別為0.5,2.0,100.0 μmol/L,但未應用于食品中抗生素殘留的檢測。

食品樣品成分復雜,傳統樣品前處理耗時長、精度低,引入誤差大[18-19],而樣品前處理技術直接關系到整個檢測過程的準確性和精密性。QuEChERs方法是目前動物抗生素殘留檢測領域備受關注的前處理技術[20],具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、耐用和安全的優點,可極大提高樣品前處理效率[21]。目前,QuEChERs方法已成功應用于SERS技術檢測食品中抗生素殘留[22-23],但將該方法與SERS技術結合檢測動物中氨基糖苷類藥物殘留的研究尚未見報道。研究擬以疏水性PP合成紙為襯底制備方陣排列SERS基底,通過QuEChERs方法對樣品進行前處理,并對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留進行定量分析,旨在為豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留提供快速、定量和高通量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸、鹽酸多巴胺、無水乙醇、4-巰基苯甲酸(4-MBA)、乙腈、乙酸、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鎂:分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;

硫酸慶大霉素、硫酸新霉素:北京索萊寶科技有限公司;

PP合成紙:上海天成紙品紙業合作公司;

試驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設備

場發射掃描電子顯微鏡:S-4800Ⅱ型,日本日立公司;

顯微共焦拉曼光譜儀:Renishaw inVia型,英國Renishaw公司;

透射電子顯微鏡:Tecnai 12型,荷蘭Philips公司;

透射電子顯微鏡:FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型,美國FEI公司;

顯微拉曼成像光譜儀:DXRxi型,美國Thermofisher公司;

紫外—可見分光光度儀:Cary UV-5000型,揚州貝歐生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AuNFs的合成 取0.4 mL HAuCl4溶液(50 mmol/L)加入到含10 mL超純水的燒杯中,劇烈攪拌混勻,加入0.8 mL鹽酸多巴胺溶液(53 mmol/L),60 ℃水浴攪拌30 min,3 000 r/min離心10 min,去除上清液,向沉淀中加入1 mL超純水,混勻得AuNFs溶液,4 ℃貯藏備用。

1.3.2 SERS基底的制備 將PP合成紙切割成2 cm×2 cm小塊,并按3×3排列,在其表面滴50 mL AuNFs溶液,自然干燥即得研究使用的方陣排列SERS基底。

1.3.3 樣品前處理 取10 g冷凍豬肉,研磨,倒入50 mL離心管中。將13.5 mL乙腈和300,150,75,15 mL乙酸滴入離心管中,得到的乙酸體積分數分別為2%,1%,0.5%,0.1%,并用超純水定容到15 mL。加入脫水劑,渦旋振蕩3 min,8 000 r/min離心5 min,取上清液于4 ℃貯藏備用。稱取一定量的硫酸慶大霉素和硫酸新霉素,加入豬肉提取液并超聲溶解。使用超純水梯度稀釋,最終得到濃度為1×10-10～1×10-3mol/L的豬肉提取液加標樣品,并將樣品滴加到制備好的基底表面,選擇激發波長785 nm,曝光時間10 s和光源強度5 mW進行SERS檢測。

增強因子(EF)是SERS檢測領域的一個重要參數,表示信號分子與納米結構表面相互作用的SERS信號的放大倍數。EF的計算需要仔細評估SERS和正常拉曼條件下的信號強度和分子數量,并按式(1)進行計算。

(1)

式中:

FE——增強因子;

ISERS——4-MBA標記的方陣排列SERS基底在當前濃度(CSERS)測量的SERS強度;

IRS——僅有4-MBA的PP合成紙在當前濃度(CRS)下的SERS強度。

1.3.4 SERS檢測條件的優化 分別考察乙酸體積分數(2.0%,1.0%,0.5%,0.1%)、脫水劑種類(NaCl、MgSO4和MgCl2)及脫水劑添加量對1×10-6mol/L氨基糖苷類抗生素濃度的豬肉提取液加標樣品SERS光譜圖的影響。

1.3.5 數據分析 樣本的拉曼光譜均采集3次,取平均值進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 AuNFs的表征

由圖1可知,AuNFs表面有許多不規則的突起,大小均一,顆粒大小約為500 nm。晶面是晶體具有一定空間角度的一系列平行平面,用垂直于平面的矢量表示。AuNFs的晶面間距為0.24 nm,表明AuNFs優先在(111)晶面生長。AuNFs溶液在473 nm處有一個吸收峰。綜上,通過一步合成法,簡單、快速合成了大小均一,形貌均勻的AuNFs。

圖1 AuNFs的結構表征圖

2.2 方陣排列SERS基底的表征

由圖2可知,PP合成紙表面有高密度的AuNFs,呈多層排列,可增強基底的SERS效應。SERS映射的顏色在1 077 cm-1處的特征峰較為規則,說明以PP合成紙為襯底的方陣排列SERS基底有良好的均勻性。4-MBA標記的方陣排列SERS基底有很強的SERS信號。當CSERS為1×10-6mol/L,CRS為1 mol/L時,EF為3.9×107,高于金納米星的[24],表明AuNFs有很強的SERS表面增強效應。

圖2 方陣排列SERS基底的表征圖

使用4個不同批次的方陣排列SERS基底分別檢測4-MBA,結果如圖2(d)所示。4次SERS光譜波形相似且在1 077 cm-1處RSD為7.01%。因此,該基底表現出良好的重現性。將制備好的SERS基底于4 ℃靜置1,7,14 d后,SERS光譜的波形和強度相似,且在1 077 cm-1特征峰處,貯藏14 d的SERS強度與貯藏1 d的相比僅下降了9.93%,說明AuNFs基底有較好的穩定性,具有疏水特性的PP合成紙阻止了水性AuNFs溶液吸收,并使AuNFs均勻地保留在PP合成紙表面,因此方陣排列SERS基底表現出良好的性能。

2.3 硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的SERS光譜圖

硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的結構式如圖3和表1所示。

表1 硫酸慶大霉素結構組成

圖3 硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的結構式

為了進一步定量檢測豬肉中硫酸慶大霉素和硫酸新霉素殘留,對其特征峰進行分析。由圖4可知,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素在997,1 074,1 572 cm-1處表現出明顯的特征峰,分別由H—N—H搖擺振動、C—O拉伸振動和N—H的彎曲振動引起[25],因此將這些特征峰歸屬于氨基糖苷類抗生素分子的SERS特征峰。而硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的SERS光譜圖分別在475,619 cm-1處表現出微弱且獨有的特征峰,是由H—N—H的扭轉振動和N—H的彎曲振動引起。因此,選擇475,619 cm-1處的峰作為硫酸慶大霉素和硫酸新霉素定性分析的特征峰,并以此處SERS信號強度確定最佳試驗條件,對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留進行定量分析。

圖4 豬肉提取液的SERS光譜圖

2.4 SERS檢測條件的優化

2.4.1 提取液 由圖5可知,當乙酸體積分數為1%時,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的特征峰明顯。因此,采用90%乙腈(1%乙酸)水溶液作為提取液。

圖5 乙酸體積分數對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS光譜圖的影響

2.4.2 脫水劑種類 由圖6可知,加入NaCl時,氨基糖苷類抗生素SERS特征峰明顯,因此,選擇NaCl作為脫水劑。

圖6 脫水劑種類對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS光譜圖的影響

2.4.3 脫水劑添加量 由圖7可知,當NaCl添加量為2 g時,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素分別在475,619 cm-1特征峰處SERS強度最大,說明此時的脫水效果最佳。因此,選擇2 g NaCl作為脫水劑。

圖7 NaCl添加量對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS強度的影響

2.5 豬肉中氨基糖苷類抗生素的定量分析

由圖8可知,隨著加標濃度的增加,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素對應特征峰SERS強度逐漸增強。硫酸慶大霉素加標濃度為1×10-10mol/L的樣品在1 074,1 572 cm-1處有特征峰,但由于氨基糖苷類抗生素特征峰的共性,僅能將其定性為氨基糖苷類抗生素殘留,不能定性為硫酸慶大霉素殘留;而在475 cm-1處未表現出明顯的特征峰,因此選擇1×10-9mol/L作為硫酸慶大霉素的最低檢測限(LOD)。硫酸新霉素加標濃度為1×10-9mol/L的樣品在619 cm-1處未表現出明顯的特征峰,因此選擇1×10-8mol/L作為硫酸新霉素的LOD。在475 cm-1特征峰處建立豬肉提取液硫酸慶大霉素加標樣品的SERS強度與濃度(1×10-9～ 1×10-3mol/L)的對數的標準曲線,線性回歸方程為y=395.98x+4 845.37,相關系數(R2)為0.991 6。在619 cm-1特征峰處建立豬肉提取液硫酸新霉素加標樣品的SERS強度與濃度(1×10-8～ 1×10-3mol/L)的對數的標準曲線,線性回歸方程為y=1 080.78x+9 280.72,R2為0.990 7。因此,方陣排列SERS基底可實現豬肉提取液加標樣品的定量檢測。

圖8 豬肉提取液硫酸慶大霉素和硫酸新霉素加標樣品的SERS光譜圖

由表2可知,試驗采用的方陣排列SERS基底檢測靈敏度高,僅次于間接競爭性化學發光酶免疫分析,且檢測速度快,有較好的穩定性,因此SERS技術對氨基糖苷類抗生素的檢測具有較高的應用前景。

表2 基于不同方法檢測氨基糖苷類抗生素

2.6 實際樣品中氨基糖苷類抗生素的測定

在最佳檢測條件下,豬肉樣品中未檢出氨基糖苷類抗生素殘留,說明該豬肉符合國家檢測標準。為驗證SERS方法的可行性,對1×10-6mol/L氨基糖苷類抗生素加標濃度的豬肉提取液樣品進行檢測,結果見表3。由表3可知,試驗方法的檢測回收率和酶聯免疫法的相近,結果無顯著性差異(P>0.05),且RSD均<8%,表明基于方陣排列SERS基底對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留的檢測方法具有較高的準確性和可行性。

表3 實際樣品中氨基糖苷類抗生素殘留的檢測結果

3 結論

研究以疏水性PP合成紙為襯底,制備了一種基于AuNFs的方陣排列SERS基底。通過與QuEChERS方法結合,快速、定量和高通量檢測豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留。基于PP合成紙的疏水特性,AuNFs聚集更加緊密,使該基底具有良好的均一性、穩定性和SERS增強效應。與傳統檢測方法相比,基于方陣排列SERS基底的檢測方法更加方便快捷、靈敏度高。后期探究不同肉類樣品對SERS信號的影響,實現肉類樣品中抗生素殘留經濟、高效、高靈敏的檢測。