液相色譜—串聯質譜法測定蜂蜜中4種喹諾酮類藥物殘留量的不確定度評定

楊 韻

曹 陽1,2

李 菁1,2

鐘菲菲1,2

左 賀3

(1. 長沙市食品藥品檢驗所,湖南 長沙 410036;2. 湖南酒類產品質量檢驗檢測中心〔湖南〕,湖南 長沙 410036;3. 湖南勞動人事職業學院,湖南 長沙 410100)

中國有著悠久的養蜂史,是全球蜂蜜生產、貿易大國,產量和出口量均居世界首位[1]。隨著現代畜牧業向規模化、集約化發展,蜂蜜中檢出獸藥的情況時有發生。2002年歐盟以抗生素(氯霉素)殘留超標為由,全面禁止中國蜂蜜進入歐盟市場,因此,抗生素殘留控制已成為食品安全工作中的重要一環,其檢測技術也是食品安全研究領域亟待解決的課題[2-3]。

喹諾酮類藥物是一種人工合成的含4-喹諾酮基本結構的類抗菌藥物,主要是將拓撲異構酶與細菌DNA螺旋酶作為靶點,抑制DNA回旋酶促進DNA復制,對細菌DNA造成不可逆損傷以發揮抗菌效果,對多種革蘭氏陰性菌的殺菌效果明顯[4-6]。喹諾酮類藥物具有抗菌活性強、抗菌譜廣泛、不良反應少、體內分布良好等多重優勢,被廣泛應用于人和動物的疾病治療[7]。腐臭病、敗血病等細菌性疾病會嚴重影響蜜蜂產蜜的產量和質量,為了蜜蜂的健康,蜂農會使用喹諾酮類藥物為蜜蜂“治病”,若產生抗藥性,則會加大用藥劑量,從而造成蜂蜜的藥物殘留[8]。研究[9]表明,長期食用含喹諾酮類藥物殘留的蜂蜜會導致人體中樞神經系統出現問題,嚴重者甚至出現肌無力的狀況,并且還有一定的致癌性。

不確定度是以測量結果本身為研究對象,由于隨機影響和系統影響的存在而對測量結果不能肯定的程度,只要是測量數據,都不可避免地存在不確定度,是客觀存在的影響檢測結果準確的因素[10-12]。為保證檢測結果的準確性,可以通過不確定度的評定來判定試驗結果的質量,因此不確定度也是測量結果的一部分,同時是評價測量活動質量的重要指標,是衡量檢測結果準確性和可靠性的重要參數[13-14]。研究擬依據GB 31657.2—2021對蜂蜜進行檢測,并參照現行有效的相關標準及指南對蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留的檢測結果進行不確定度評定[15-17],分析檢測過程中各測量不確定度分量對結果的影響,找出需要重點關注的環節,為實驗室內部質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜:抽檢樣品;

水:GB/T 6682規定的一級水;

甲醇、乙腈:色譜純,德國MERCK公司;

甲酸:色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

恩諾沙星(CAS No:93106-60-6)、鹽酸沙拉沙星(CAS No:91296-87-6)、氧氟沙星(CAS No:82419-36-1)、環丙沙星(CAS No:85721-33-1):北京曼哈格生物科技有限公司;

其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

液相色譜串聯三重四極桿質譜儀:Triple Quad 5500+型,美國AB SCIEX公司;

固相萃取柱:Oasis PRiME HLB型,200 mg/6 mL,美國Waters公司;

分析天平:XS205DU型,德國Mettler toledo公司;

高速冷凍離心機:X1R型,賽默飛世爾科技有限公司;

氮吹儀:N-EVAP45型,美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制備 分別精密稱取恩諾沙星0.010 08 g、鹽酸沙拉沙星0.011 26 g、氧氟沙星0.010 13 g、環丙沙星0.010 35 g,用0.5 mL氨水溶解,并用甲醇定容至10 mL容量瓶,配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液;用移液管準確量取0.1 mL各標準儲備液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質量濃度為1 μg/mL的混合標準中間液;分別準確吸取0.10,0.20,0.50,1.00,2.00,5.00 mL混合標準中間液于100 mL容量瓶中,用20%乙腈—甲酸水溶液(20 mL乙腈中加入80 mL 0.1%甲酸溶液)定容,配制成質量濃度分別為1,2,5,10,20,50 ng/mL的標準系列工作液,各取1.00 mL,分別加入經提取、凈化處理的空白試料中,溶解殘余物,上清液過微孔尼龍濾膜后,上機測定。

1.3.2 樣品前處理

(1) 提取:稱取2.024 3 g蜂蜜樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入磷酸鹽緩沖液20 mL,渦旋1 min,振蕩10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液備用。

(2) 凈化:固相萃取柱分別用10 mL甲醇、10 mL水活化,將備用上清液過柱,用5 mL水淋洗,抽干后依次用4 mL 5%的甲酸—甲醇和4 mL乙酸乙酯洗脫,抽干后收集洗脫液,40 ℃氮氣吹干。用1.00 mL 20%乙腈—甲酸水溶液溶解殘余物,超聲1 min后渦旋混勻,上清液過尼龍濾膜,待測。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18,2.1 mm×100 mm,1.8 μm;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇;按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 質譜條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS)5 000 V;離子源溫度(TEM)500 ℃;霧化氣壓力(GS1)379 kPa;霧化氣壓力(GS2)379 kPa;氣簾氣壓力(CUR)207 kPa;碰撞器(CDA)62 kPa,質譜參數設置見表2。

表2 多反應監測模式下6種化合物的質譜分析參數

1.3.5 數學模型建立 按式(1)建立數學模型。

(1)

式中:

X——樣品中相應的喹諾酮類藥物殘留量,μg/kg;

Cs——基質標準溶液中相應的喹諾酮類藥物質量濃度,ng/mL;

As——基質標準溶液中相應的喹諾酮類藥物峰面積;

A——樣品溶液中相應的喹諾酮類藥物峰面積;

V——溶解殘余物溶液體積,mL;

m——樣品質量,g。

1.3.6 不確定度分量的主要來源分析 根據試驗步驟和數學模型進行分析,影響樣品中喹諾酮類藥物殘留量的測量不確定度主要有:標準溶液配制與稀釋過程引入的不確定度;標準曲線擬合引入的不確定度;樣品稱樣量引入的不確定度;樣品定容體積引入的不確定度;測量重復性引入的不確定度;加標回收引入的不確定度。

2 結果與分析

2.1 標準溶液配制與稀釋過程引入的不確定度urel(C)

2.1.1 標準物質純度引入的相對標準不確定度urel(Cp)

2.1.2 標準物質稱量引入的相對標準不確定度urel(Cw)

2.1.4 混合標準中間液制備過程引入的相對標準不確定度urel(Cs) 配制質量濃度為1 μg/mL的混合標準中間液需要用到1支1 mL A級分度吸量管,1個100 mL A級單標線容量瓶。取均勻分布,量具及溫度波動引入的不確定度見表3。

表3 混合標準中間液制備過程引入的不確定度

因此,由混合標準中間液制備過程引入的相對標準不確定度為:

(1)

表4 吸量管引入的不確定度

綜上,標準系列工作液制備過程引入的相對標準不確定度為:

標準溶液配制與稀釋過程引入的相對標準不確定度為:

(2)

計算得:urel(C恩)=0.071 21;urel(C沙)=0.071 37;urel(C氧)=0.071 22;urel(C環)=0.071 22。

2.2 標準曲線擬合引入的不確定度urel(F)

標準系列工作液6個濃度,每個濃度測定3次,用最小二乘法擬合標準系列工作液各質量濃度與峰面積,以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到的線性回歸方程見表5。被測樣品重復測定6次,分別從標準曲線上擬合得到喹諾酮類藥物殘留量見表6。

表5 標準曲線

表6 樣品重復測定數據

按式(3)、式(4)計算標準曲線擬合引入的相對標準不確定度。

(3)

(4)

式中:

urel(F)——標準曲線擬合引入的相對標準不確定度;

S——標準溶液峰面積比殘差的標準差;

c0——由標準曲線擬合得到的樣品中喹諾酮類藥物殘留量的平均質量濃度,ng/mL;

a——線性回歸方程的斜率;

P——樣品重復測定次數,P=6;

m——標準曲線的濃度個數,m=6;

n——標準曲線每個濃度溶液測定次數,n=3;

ci——第i個由標準曲線擬合的標準溶液質量濃度,ng/mL;

Aj——第j個標準溶液的峰面積;

cj——第j個標準溶液的配制質量濃度,ng/mL;

b——線性回歸方程的截距。

將各值代入式(4)得:S恩=37 163.680 38,S沙=16 132.613 53,S氧=110 103.370 46,S環=96 300.170 38;urel(F恩)=0.034 86,urel(F沙)=0.014 74,urel(F氧)=0.032 26,urel(F環)=0.012 58。

2.3 樣品稱樣量引入的不確定度urel(M)

2.4 樣品定容體積引入的不確定度urel(V)

2.5 測量重復性引入的不確定度urel(R)

在空白蜂蜜樣品中分別添加質量濃度為5,10,8,15 μg/kg的恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星和環丙沙星,從樣品稱量開始重復測定6次(n=6),測量結果見表6。用貝塞爾公式(5)～式(7)計算測量重復性引入的相對標準不確定度。

(5)

(6)

(7)

計算得:urel(R恩)=0.012 38,urel(R沙)=0.023 12,urel(R氧)=0.015 76,urel(R環)=0.018 39。

2.6 加標回收引入的不確定度urel(A)

取6份空白樣品,在恩諾沙星5 μg/kg、沙拉沙星10 μg/kg、氧氟沙星8 μg/kg、環丙沙星15 μg/kg質量濃度下進行加標回收,樣品回收率見表7。

表7 樣品回收率

計算得:urel(A恩)=0.010 18,urel(A沙)=0.015 20,urel(A氧)=0.009 90,urel(A環)=0.006 56。

3 合成標準不確定度與擴展不確定度

根據各不確定度分量得,相對合成標準不確定度為:

urel沙=0.078 09;urel氧=0.080 50;urel環=0.075 05。

根據RB/T 030—2020,以恩諾沙星為例,當恩諾沙星含量為4.97 μg/kg時,其合成標準不確定度u恩=4.97×0.081 02=0.403 μg/kg,擴展不確定度U恩=u恩×k=0.403×2=0.81 μg/kg。則u沙=0.791 μg/kg,U沙=1.58 μg/kg;u氧=0.617 μg/kg,U氧=1.23 μg/kg;u環=1.123 μg/kg,U環=2.25 μg/kg(取包含因子k=2,置信水平P=95%)。

4 測量結果及其不確定度報告

采用液相色譜—串聯質譜法測定蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留量,恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、環丙沙星的測量不確定度結果分別表示為:X恩=(4.97±0.81) μg/kg;X沙=(10.13±1.58) μg/kg;X氧=(7.67±1.23) μg/kg;X環=(14.97±2.25) μg/kg。

5 結論

研究采用液相色譜—串聯質譜法對蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留量進行了測定,通過建立數學模型對試驗過程中引入的不確定度各分量進行了評定。結果表明,標準溶液配制與稀釋過程、標準曲線擬合對試驗的不確定度結果貢獻最大且不容忽視,其次是樣品重復性測定和加標回收。因此,在測定蜂蜜中喹諾酮藥物殘留量的實際工作中,要確保標準溶液配制及稀釋精準,選擇精密度高的移液器和容量瓶,增加標準溶液、樣品的測量次數,多做平行測定,提高檢驗操作技術,定期維護保養測量儀器,從而降低操作過程中各不確定度分量對檢測結果的影響,提高檢測結果的準確度。

方法GB 31657.2—2021包含了14種喹諾酮藥物,試驗只選取了其中4種較常見、易檢出、具有一定代表性的藥物,其中,2021年國家食品安全監督抽查計劃將氧氟沙星列為蜂產品的風險監測項目。但該研究未考慮方法中其余10種藥物的不確定度,加標濃度相對隨機,且未考慮檢測儀器對試驗結果帶來的影響,對實際工作的指導仍然存在一定的局限性。因此,在日常檢測工作中應該以檢出結果為目標,綜合全面考慮不確定度來源,才能使檢測結果更加準確、科學、規范。