同位素內標法—超高效液相色譜/串聯質譜法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量

石金娥

張洪禹3

辛若竹4

丁 梅4

奚廣生1,2

(1. 梧州學院食品與制藥工程學院,廣西 梧州 543002;2. 梧州學院六堡茶現代產業學院,廣西 梧州 543002;3. 梧州學院體育健康學院,廣西 梧州 543002;4. 梅河口市食品藥品檢驗檢測中心,吉林 梅河口 135000)

六堡茶為黑茶的一種,以“紅、濃、陳、醇”著稱。與其他茶樹一樣,六堡茶茶樹每年也會受小綠葉蟬、茶尺蠖、茶毛蟲、茶麗紋象甲等蟲害的侵襲[1-3]。茶園中常用苦參堿、印楝素、魚藤酮、藜蘆堿等植物源農藥防治小綠葉蟬、茶尺蠖等蟲害[4-7],植物源農藥已成為茶園病蟲害綠色防控的新趨勢[8-10]。其中苦參堿和氧化苦參堿屬于喹諾里西啶類生物堿,為高效、廣譜植物源殺蟲劑[11],聯合使用更具速效和持久毒殺效果[12-15]。但一定劑量的苦參堿和氧化苦參堿會導致神經、肝損傷等[16]。

GB/T 19630—2019中有機產品可以施用苦參堿和氧化苦參堿等植物源農藥,但GB 2763—2021中卻未對茶葉中苦參堿和氧化苦參堿的施用殘留量及檢測方法做出任何規定。目前,有關苦參堿檢測的研究較多,而氧化苦參堿的研究卻鮮見報道[17],主要涉及的檢測技術有GC技術[18]、LC技術[19]、GC/MS技術[20-21]、HPLC-MS/MS技術等[22-23],多采用外標法或基質外標法為主要定量方法,且多數方法回收率不高[24-26]。

研究擬結合苦參堿和氧化苦參堿的性質,通過優化色、質譜條件及樣品前處理過程,采用同位素內標法定量,建立UPLC-MS/MS法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的測定方法,為茶葉中苦參堿和氧化苦參堿殘留量檢測以及風險評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甲醇、甲酸、乙腈、甲酸銨:色譜純,美國MREDA公司;

濃氨水、無水硫酸鈉:化學純,北京化工廠;

QEChERS提取鹽 (1.5 g NaAc,6 g MgSO4)、QuEChERS凈化管1(15.1 mg GCB,147.7 mg PSA,887.2 mg MgSO4)、QuEChERS凈化管2(200 mg GCB,400 mg C18,400 mg PSA,1 200 mg MgSO4):美國Agilent公司;

0.2 μm濾膜:美國Pall公司;

苦參堿、氧化苦參堿標準物質:純度≥98.9%,美國 Cerilliant 公司;

苦參堿-D3、氧化苦參堿-D3:純度≥98%,加拿大Trc公司;

六堡茶樣品:不同年份、不同季節的六堡茶16批次(2012年春茶、2012年秋茶、2012年老樹茶、2014年夏茶、2014年秋茶、2016年社前茶、2016年明前茶、2018年春茶、2018年秋茶、2020年春茶、2020年秋茶、2020年老茶婆、2020年金花茶、2022年春茶、2022年秋茶、2022年老茶婆),市售。

1.1.2 主要儀器設備

超高效液相色譜—串聯質譜儀:TSQ Endura型,美國 Thermo Fisher公司;

渦旋混合器:IKA型,歐萊博科學儀器有限公司;

超聲波清洗器:DQ-110E型,瑞萊博科技有限公司;

離心機:Allegra 64 型,美國Beckman公司;

氮吹儀:TTL-DC型,聯泰科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

(1) 標準儲備液:以甲醇為溶劑分別配制苦參堿、氧化苦參堿、苦參堿-D3、氧化苦參堿-D3標準儲備液(1 mg/mL),于-18 ℃避光保存。

(2) 混合標準使用液:取苦參堿和氧化苦參堿標準儲備液,用50%的甲醇溶液(含0.1%甲酸)配制,得到質量濃度分別為10,100 μg/L的苦參堿和氧化苦參堿混合標準使用液。

(3) 內標使用液:取苦參堿-D3和氧化苦參堿-D3標準儲備液,用50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)配制,得到苦參堿-D3質量濃度為10 μg/mL,氧化苦參堿-D3質量濃度為1 μg/mL。

(4) 混合標準工作溶液:分別吸取10 μg/L的混合標準使用液10,50,100 μL及100 μg/L的混合標準使用液50,100,200,500,800 μL于樣品瓶中,加內標使用液10 μL,用含0.1%甲酸的甲醇溶液(V甲酸∶V甲醇為1∶1)定容至1.0 mL,混勻。配制的混合標準工作溶液質量濃度分別為0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,80.0 μg/L。其中苦參堿-D3質量濃度為100 μg/L,氧化苦參堿-D3質量濃度為10 μg/L。

1.2.2 樣品前處理 稱取0.5 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL玻璃離心管中,加入50 μL內標混合使用液,加入10 mL含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1),渦旋60 s,超聲10 min,加入5 g無水Na2SO4,再次渦旋2 min,離心5 min(9 500 r/min,4 ℃)。吸取5.0 mL上清液于QuEChERS凈化管1中,渦旋2 min,離心5 min(5 000 r/min,4 ℃)。將2.00 mL上述液體轉移至另一支10 mL玻璃離心管中,氮吹近干(40 ℃水浴),加入1.0 mL含0.1%甲酸的50%甲醇溶液溶解殘渣,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜,上機測定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?(100 mm×3.0 mm)或等效柱;柱溫35 ℃;流動相A泵為水相 (0.1%甲酸),B泵為甲醇相 (0.1%甲酸),流速0.35 mL/min;進樣量5 μL;洗脫程序見表1。

表1 流動相配比及洗脫條件

1.2.4 質譜條件 電離方式為電噴霧離子源正離子模式,多反應監測模式采集;電噴霧電壓5 500 V;氣簾氣壓力207 kPa;輔助氣壓力483 kPa;霧化氣壓力345 kPa;離子源溫度500 ℃;碰撞氣6 mL/min;離子對、保留時間等參數見表2。

表2 去簇電壓、離子對及碰撞能量值?

1.2.5 線性范圍測定 按優化后的參數和條件對標準工作液系列進行測定,以苦參堿標準溶液中待測組分峰面積與相應氧化苦參堿內標物峰面積的比值為縱坐標,苦參堿標準溶液中待測組分濃度與相應氧化苦參堿內標物濃度的比值為橫坐標,繪制內標—校準工作曲線。

1.2.6 定量限及檢出限測定 向基質中添加一定濃度的目標物及內標物,以3倍信噪比(S/N=3)對應的目標物濃度計算檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)對應的目標物濃度計算定量限。

1.2.7 回收率和精密度測定 向基質中定量添加目標物及內標物,按建立的方法測定6次,并計算方法回收率和精密度。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑選擇 因苦參堿和氧化苦參堿為堿性水溶性化合物[23],考慮茶葉基質(含鞣酸等酸性物質)的特殊性,僅對中性和堿性提取體系進行考察。分別對水復溶+1%氨水乙腈提取、水復溶+含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1)提取和直接用含0.2%氨水的乙腈水溶液(V氨水∶V乙腈為4∶1)提取3種方式進行回收率考察。試驗發現,直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)對茶葉樣品進行提取的回收率最高,可能是水的前期參與會使茶葉溶出大量的酸性物質,這些酸性物質會與苦參堿發生反應[25],導致回收率較低;但直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)提取時,因過量的氨水可以中和茶葉基質中的酸性物質,保護了苦參堿,從而有利于提取效率的提升。當直接用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)提取時,苦參堿回收率為93.8%～103.7%,氧化苦參堿回收率為92.0%～104.7%,結果均滿意。

2.1.2 凈化方法優化 分別選用無水硫酸鈉和QuEChERS鹽為提取鹽,用80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)對加標樣品進行提取,選擇QuEChERS凈化管1、QuEChERS凈化管2進行凈化,考察凈化方式對回收率的影響。由表3可知,當以無水硫酸鈉為提取鹽QuEChERS凈化管1凈化時,苦參堿和氧化苦參堿的回收率較好,其余組合回收率均較低,可能是QuEChERS凈化管2中大量的石墨化炭黑(GCB)對苦參堿和氧化苦參堿有較強的吸附[24],導致苦參堿和氧化苦參堿的回收率偏低。

表3 凈化方法對回收率的影響

2.2 儀器條件優化

2.2.1 色譜條件優化 分別以0.1%甲酸水—甲醇、0.1%甲酸水—0.1%甲酸—甲醇、0.1%甲酸水—0.1%甲酸—乙腈、5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)—0.1%甲酸—甲醇為流動相,考察不同配比的流動相對目標物的洗脫效果,結果見表4。由表4可知,以甲醇為主體的流動相使得苦參堿和氧化苦參堿的響應值和分離效果均較好,且甲酸濃度增加后,響應效果更顯著;甲酸銨的存在同樣能得到較高的響應值和較好的分離效果,但從配制便捷的角度考慮,優先選擇0.1%甲酸水—0.1%甲酸—甲醇為流動相。

表4 流動相對苦參堿和氧化苦參堿響應值的影響

2.2.2 質譜條件優化 按試驗條件進樣分析,進一步驗證所選離子對的響應值和穩定性,最終確定了4種目標物的離子對,苦參堿和氧化苦參堿及內標物溶液的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 苦參堿、氧化苦參堿及內標物的MRM色譜圖

2.3 方法的校準曲線和檢出限

由表5可知,苦參堿和氧化苦參堿在0.1～80.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好,相關系數均>0.999 6。以3倍信噪比(S/N=3)對應的加標量為檢出限,10倍信噪比(以S/N=10)對應的加標量為定量限,測得苦參堿和氧化苦參堿的檢出限均為1.0 μg/kg,定量限均為3.0 μg/kg。

表5 校準曲線及線性范圍

2.4 方法的精密度和加標回收率

茶葉樣品按5個濃度水平加標,分別測定6次,其回收率及相對標準偏差見表6。由表6可知,苦參堿的相對標準偏差為1.7%～4.8%,回收率為93.8%～103.7%;氧化苦參堿的相對標準偏差為2.1%～5.3%,回收率為92.0%～104.7%;均滿足GB/T 27404—2008的要求,說明試驗方法準確可靠。

表6 精密度及回收率結果

2.5 樣品測試

對采購的16種不同年份、不同季節的六堡茶進行測定,結果顯示,苦參堿和氧化苦參堿均未檢出,說明在苦參堿和氧化苦參堿類生物類農藥考察中,六堡茶具有較高的安全性。

3 結論

通過對色譜、質譜條件及樣品前處理過程的不斷優化,建立了一種內標法測定六堡茶中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的方法。該方法縮短了茶葉中苦參堿和氧化苦參堿的前處理周期,提高了檢測效率,且該方法具有良好的線性范圍和較高的回收率,靈敏度、準確度、精密度均滿足GB/T 27404—2008要求。對市售六堡茶進行摸底,結果顯示六堡茶中均未檢出苦參堿和氧化苦參堿。后續將以六大茶類為研究對象,確認該方法在六大茶類中的適用性,同時對市售六大茶類在施用苦參堿和氧化苦參堿殺蟲劑的安全性進行考察,以期該方法有更廣泛的適用性。