微孔板法測定乳粉中葉酸含量的不確定度分析

劉子音

卓一鳴

劉臘蘭

彭 納

吳后呂

(長沙市食品藥品檢驗所,湖南 長沙 410016)

葉酸,或稱維生素B9、維生素M,廣泛參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸的代謝和細(xì)胞增殖,并且是血紅蛋白的組分之一,對人體尤其是孕婦和嬰幼兒的健康至關(guān)重要[1]。孕婦缺乏葉酸可致胎兒畸形,嬰幼兒缺乏葉酸會阻礙神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及引發(fā)巨幼細(xì)胞性貧血[2-4]。中國食品安全標(biāo)準(zhǔn)對嬰、幼兒配方食品中葉酸含量都有強(qiáng)制性要求[5]。葉酸含量的檢測方法主要有液相色譜法[6-9]、分光光度法[8-9]、酶聯(lián)免疫法[10-11]、微生物法[12-13]等。由于葉酸不穩(wěn)定,見光、受熱易分解[14],因此不適于采用理化方法檢測。目前,微生物法是GB 5009.211—2022指定的仲裁方法,并在2014版的試管法基礎(chǔ)上增添了新的微孔板法。微孔板法相較于試管法所耗試劑更少,測定更加快捷,但因培養(yǎng)體積變小,試驗的不確定性發(fā)生變化。研究擬按GB 5009.211—2022中微孔板法對嬰兒配方乳粉中的葉酸含量進(jìn)行同條件下的10次平行測定,依據(jù)CNAS-CL01-G003:2021、CNAS-GL05:2011、JJF 1059.1—2012等標(biāo)準(zhǔn)對影響檢測結(jié)果的各種因素進(jìn)行分析和評估,計算各分量的不確定度,綜合處理后得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度[15],以期為實驗室質(zhì)量控制和試驗流程優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 耗材試劑

嬰兒配方乳粉:長沙市食品藥品檢驗所抽檢樣;

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.0%,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;

鼠李糖乳桿菌:ATCC7479,美國模式培養(yǎng)物保藏中心;

菌種儲備用瓊脂培養(yǎng)基、葉酸測定用培養(yǎng)基:北京路橋技術(shù)股份有限公司;

微孔板(96孔)、濾膜(0.22 μm):美國康寧公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平:BSA224S型,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;

高壓滅菌器:SM830型,重慶雅馬拓科技有限公司;

生化培養(yǎng)箱:LRH-250F型,上海一恒科技有限公司;

移液器:1 mL、200 μL量程,美國Eppendorf公司;

容量瓶:100,1 000 mL容積,湖南湘玻科學(xué)儀器有限公司;

多功能酶標(biāo)儀:Ensight型,新加坡PerkinElmer公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 參照GB 5009.211—2022。

1.2.2 接種液的制備 按GB 5009.211—2022要求操作,將鼠李糖乳桿菌菌種轉(zhuǎn)接至菌種儲備用瓊脂培養(yǎng)基中,(36±1) ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h,連續(xù)傳種2～3代,挑取單菌落接種至含有葉酸的葉酸測定用培養(yǎng)液中,(36±1) ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h,轉(zhuǎn)接至不含葉酸的葉酸測定用培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)6 h,得到接種液。

1.2.3 樣液制備 稱取約0.1 g樣品于錐形瓶中,加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液,具塞,超聲振蕩2 h,轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中,用無菌水定容。取1 mL無菌水稀釋10倍,過濾除菌,得到樣品待測液。

1.2.4 樣品測定 按GB 5009.211—2022中微孔板法制備試樣系列管和標(biāo)準(zhǔn)系列管(均過濾除菌),與含有接種液的測定用培養(yǎng)基(40 μL接種液/10 mL培養(yǎng)基)各150 μL一起轉(zhuǎn)接至微孔板,覆膜,混勻,于(36±1) ℃恒溫培養(yǎng)32～40 h,用酶標(biāo)儀快速測定540 nm處吸光值(若0對照孔出現(xiàn)渾濁,說明可能有雜菌污染,需重做)。

1.2.5 數(shù)學(xué)模型的建立 按式(1)計算樣品中葉酸含量。

(1)

式中:

X——樣品中葉酸含量,μg/100 g;

c——樣品待測液葉酸濃度的平均值,ng/mL;

V——樣品溶液定容體積,mL;

f——樣品溶液稀釋倍數(shù);

m——樣品稱取量,g。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 對各分布類型數(shù)據(jù)的處理方法及運(yùn)用到的計算公式參考JJF 1059.1—2012;標(biāo)準(zhǔn)曲線的二項式回歸方程由Excel程序生成;二項式方程轉(zhuǎn)換為直線方程的處理方法參考相關(guān)文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

微孔板法測定葉酸含量過程中的不確定度來源主要有:① 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度,包括標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量、稀釋,標(biāo)準(zhǔn)系列管的配制;② 樣液制備引入的不確定度,包括樣品的稱量和稀釋,試樣系列管的配制;③ 接種微孔板過程引入的不確定度;④ 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度;⑤ 酶標(biāo)儀儀器誤差產(chǎn)生的不確定度;⑥ 測量重復(fù)性引入的不確定度。

2.2 各不確定度分量評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程量具校準(zhǔn)引入的不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的相對不確定度:

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列管配制過程量具校準(zhǔn)引入的不確定度

2.2.2 樣液制備引入的不確定度

表3 樣品待測液配制過程量具校準(zhǔn)引入的不確定度

2.2.4 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度 試驗原理是利用鼠李糖乳桿菌的生長速率與環(huán)境中葉酸含量成正比,通過檢測菌液濁度可反映培養(yǎng)基中初始葉酸含量。理想狀態(tài)以葉酸初始含量為橫軸,吸光度為縱軸建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線,但由于培養(yǎng)過程中葉酸不斷消耗,乳桿菌產(chǎn)生的有害代謝物不斷累積,實際的生長曲線會逐漸趨于平緩,因此將標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合成二次方程較為符合實際情況,具體數(shù)據(jù)見表4,得回歸方程Y=-232.52x2+22.775x+0.182 1,R2=0.997 4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗數(shù)據(jù)

先將二次曲線方程轉(zhuǎn)化成一次直線方程[16]:

Y=-232.52x2+22.775x+0.182 1=-232.52(x-0.049 0)2+0.739,令Z=(x-0.049 0)2,則原方程可以轉(zhuǎn)化為Y=aZ+b=-232.52Z+0.739,斜率a=-232.52,截距b=0.739,標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)點吸光度值殘差的標(biāo)準(zhǔn)差:

(2)

式中:

n——標(biāo)準(zhǔn)系列管孔數(shù);

Yi——儀器測得的各標(biāo)準(zhǔn)系列管吸光度值(即表4中A1～A3數(shù)值);

aZi+b——由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算得的理論吸光度值(見表5)。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線各校準(zhǔn)點葉酸含量離均差及吸光度值殘差

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度:

(3)

式中:

p——試樣系列管孔數(shù);

C——測得的各試樣系列管葉酸含量轉(zhuǎn)換為Z后的平均值;

Zi——各標(biāo)準(zhǔn)系列管葉酸含量轉(zhuǎn)換為Z后的值;

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜上,接種微孔板、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和測量重復(fù)性三者對試驗結(jié)果影響較大:接種微孔板引入的不確定度主要來自所使用移液器的校準(zhǔn);擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度主要與微生物生長狀況的發(fā)散性相關(guān);測量重復(fù)性引入的不確定度與試驗儀器精密度、人員操作穩(wěn)定性及微生物生長狀況的發(fā)散性相關(guān),其中后者起關(guān)鍵作用。

將各不確定度分量綜合計算,得到此次葉酸測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4 擴(kuò)展不確定度

該檢測結(jié)果屬于正態(tài)分布,當(dāng)置信水平為95%時,包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度U=u(X)×k=11.04×2=22.08 μg/100 g。此次測定的乳粉樣品中葉酸含量可表示為(282.33±22.08) μg/100 g。

3 結(jié)論

微孔板法的引入是國標(biāo)葉酸測定方法的一次優(yōu)化,其相較于傳統(tǒng)的試管法,首先成倍減少了培養(yǎng)基的用量,降低了試驗成本。其次,標(biāo)準(zhǔn)管和試樣管改用過濾滅菌替代高壓滅菌,避免了葉酸受熱分解影響檢測結(jié)果。再次,使用一次性微孔板代替試管,一方面避免了試管因未洗凈帶入殘留造成不良影響,一方面微孔板可以直接使用酶標(biāo)儀一次性讀取全部孔結(jié)果,避免了使用分光光度計時逐管測定頻繁操作造成的干擾。但新方法有其相應(yīng)的不確定性。

試驗表明,該樣品中葉酸含量可表示為(282.33±22.08) μg/100 g(置信度95%)。新增的接種微孔板步驟以及擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、測量重復(fù)性,三者是不確定度的主要來源。接種微孔板過程需頻繁使用移液器,選用質(zhì)量較好的移液器能有效降低該不確定度分量。后二者涉及鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng),而微生物的生長狀況發(fā)散性較大,其影響因素主要有:所用菌株的活性、樣品基質(zhì)所含雜質(zhì)、培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)條件如溫度、時長[17]。因此,選用性狀穩(wěn)定、正規(guī)來源的新鮮標(biāo)準(zhǔn)菌株,確保待測樣品不含除葉酸外影響鼠李糖乳桿菌生長的其他成分,選用正規(guī)廠商培養(yǎng)基并嚴(yán)格按要求配制,使用經(jīng)檢定的恒溫培養(yǎng)箱,在適宜的菌液濃度(孔底未出現(xiàn)沉淀)時收取等措施能盡可能降低微生物因素引起的不確定度。 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稱量、稀釋,標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液的配制,以及酶標(biāo)儀的儀器誤差是不確定度的次要來源,可通過使用精密度更高的儀器并注意維護(hù)保養(yǎng)、定期檢定以減小該部分的影響。