突觸后密度蛋白-95在三陰型乳腺癌外泌體中的表達情況及與臨床病理特征的相關性

王玉潔, 李 婷, 孜拉蘭·玉山江, 李鴻濤

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺甲狀腺外科, 烏魯木齊 830011)

據(jù)2020年WHO報道,乳腺癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率最高,超過了肺癌,位居第一位。乳腺癌的新發(fā)患者人數(shù)約260萬,中國約42萬,而且逐年呈現(xiàn)上升趨勢[1]。由于該疾病的致死率較高,嚴重威脅到女性患者的身心健康[2]。外泌體是一種細胞內(nèi)囊泡,它形成于多囊泡體和細胞膜的融合過程,并通過此過程被釋放出來[3]。外泌體是細胞內(nèi)多泡體內(nèi)形成腔內(nèi)囊泡,轉(zhuǎn)移到細胞外[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體可基于和受體結合或被內(nèi)化的方式,進入受體細胞,并對靶細胞產(chǎn)生影響[6]。因此,外泌體在向周圍或遠處細胞傳遞信號中發(fā)揮著重要作用。

Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn),突觸后密度蛋白95(PSD-95,又稱DLG4)在結直腸癌組織中低表達,這與結直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關。本研究旨在通過實驗分析突觸后密度蛋白95(PSD-95、DLG4)在三陰型乳腺癌患者中的表達情況及臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2018年1月在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺甲狀腺腫瘤研究中心的4例三陰型乳腺癌患者及4例乳腺良性腫瘤患者的樣本,通過生物信息學方法測定其相關基因表達情況,且進行對比[8],選擇高通量測序方法進行檢測[9],以獲得兩組樣品的mRNA-seq數(shù)據(jù)。同時收集同期36例三陰型乳腺癌患者的術前穿刺或術中病理組織標本和30例乳腺良性腫瘤患者的組織標本,用于對候選mRNA表達水平的分析。本研究已通過新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(K-2021076),并通過了所有參加研究的患者及其家屬的書面知情同意。

1.2 納入與排除標準參照中國癌癥學會《乳腺癌診療指南(修訂版)》2020年度報告編制的入選和剔除標準。 納入標準:(1)侵襲性無特異性乳癌的病理學確診者;(2)經(jīng)免疫組化檢驗;(3)首次就診時未接受化學藥物、放射和其他臨床療法者。排除標準:(1)臨床病理資料不完整者;(2)失訪患者。(3)不符合上述納入標準的均予以剔除。

1.3 試劑和儀器包埋機(PBM-B)來源于常州普瑞斯星公司;微量移液器和離心機(TDZ5-WS)來源于湖南湘鑫儀器儀表有限公司;免疫組化染色試劑盒、DLG4抗體(#AF5283)購自Affinity抗體公司;外泌體提取試劑盒(76064)購自QIAGEN公司。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序和外泌體的分離純化將樣品迅速溶解后加1倍劑量的 XBP,反轉(zhuǎn)混合后向 exoEasy離心機中添加混合液進行3 min的旋轉(zhuǎn)離心,再靜置5 min;然后將10 mL的緩沖劑 XWP添加到2 810×g的離心器中7 min,將剩余的緩沖劑去除。將轉(zhuǎn)動的色譜塔移至新的收集管內(nèi),在薄膜上添加600 μL的緩沖劑 XE,培養(yǎng)3 min。在500×g的條件下,5 min后,萃取洗脫劑,再回柱,再加入外部易旋柱,溫育3 min;對分離出的外泌體測序,據(jù)此確定出相應mRNA-seq,然后篩選出品質(zhì)較好的外泌體。以已知的GRCh38為參照物完成測序。使用HISAT2軟件進行比較,使用 StringTie軟件將比較得到的讀數(shù)進行組合,以此為基礎建立多變量的剪切圖和交通網(wǎng)絡;按照最大通信量的計算方法,將讀數(shù)組合起來,并對它們的表達量進行估計。

1.5 差異表達的mRNA鑒定利用Limma分析技術,以|log FC|>1,Pvalue<0.05為篩選條件,對獲得的外泌體進行mRNA分析。差異倍數(shù)(Fold Change, FC)是指兩個群體之間的表達量之比。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

1.6 與mRNA差異表達有關的信號途徑分析對比以上各基因的 KEGG和GO數(shù)據(jù),基于GO富集性研究,深入研究其生物學過程、分子功能,以及其在細胞內(nèi)的組成。本研究發(fā)現(xiàn)相對于全基因組背景,這些mRNA具有顯著豐富度的KEGG通路和GO項目。說明這些mRNA在特定的生物學進程和分子功能中發(fā)揮重要作用。

1.7 免疫組織化學染色法驗證候選mRNA將三陰乳腺癌組織及正常組織取材后用生理鹽水沖洗干凈后置于10%中性福爾馬林溶液中固定,然后根據(jù)取材、包埋、切片、烤片、脫蠟、水化、抗原修復等免疫組化標準方法進行實驗后,在光學顯微鏡下觀察組織切片,并按照評分標準[10]進行評分。一抗稀釋液一般為PBS,抗體名稱:PSD-95(DLG4),通過預實驗確定準確稀釋倍數(shù)為:1∶200。根據(jù)陽性染色強度分為4個等級:0分為陰性(無色),1分為淺黃色(弱陽性),2分為棕黃色(中等陽性),3分為棕褐色(強陽性)。根據(jù)陽性染色的腫瘤細胞比例分為5個等級:0分,陽性細胞<5%;1分,陽性細胞占6%～25%;2分,陽性細胞占26%～50%;3分,陽性細胞占51%～75%;4分,陽性細胞>75%。綜合兩項評分:總分范圍為0～8分,0分評級為不表達,1～2分評級為低表達,3～8分評級為高表達。

2 結果

2.1 外泌體測序分析差異表達的mRNA通過對基因序列的分析,發(fā)現(xiàn)90條基因在mRNA水平上的差異,11條在基因水平上顯著升高,79條在下降。圖1、圖2為 DEG的火山圖和熱流圖。

圖1 兩組患者外泌體中差異表達的mRNA

圖2 差異性顯著mRNA的聚類分析

2.2 mRNA功能性富集分析的差異性表達結果經(jīng)GO、KEGG-Pathway等方法檢測,篩選出差異表達 mRNAs,其主要參與細胞自噬、NIK/NF-κB信號的調(diào)節(jié)等;在細胞器成分領域中涉及到胞漿、突觸部分等,其參與的生物過程包括蛋白磷酸酶結合、GTP酶抑制劑活性的調(diào)控等(圖3)。同時,在KEGG-Pathway中,這些mRNA涉及到的信號途徑有硫酸鹽代謝途徑、半胱氨酸等(圖4)。

圖3 差異表達mRNA 的GO富集分析氣泡圖

圖4 差異表達mRNA的KEGG富集分析柱狀圖

PSD-95(DLG4)為其中一個具有顯著差異性的mRNA。因此將PSD-95(DLG4)確定為候選mRNA,并應用免疫組化技術檢測三陰型乳腺癌和乳腺良性腫瘤中該基因的表達。

2.3 PSD-95(DLG4)在三陰型乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤組織中的表達水平PSD-95(DLG4)在三陰型乳腺癌組織中的表達水平(4.17±2.13)顯著低于乳腺良性腫瘤組織(7.87±0.346)。三陰型乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤組織PSD-95(DLG4)免疫組化染色結果見圖5。

樣本分類40×100×200×400×三陰型乳腺癌組織乳腺良性腫瘤組織

2.4 三陰型乳腺癌中PSD-95(DLG4)蛋白的表達及其與臨床病理的相關性與PSD-95(DLG4)低表達的三陰型乳腺癌相比,PSD-95(DLG4)高表達的三陰型乳腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移率(N)大幅度下降;PSD-95(DLG4)的差異表達與乳腺癌患者淋巴結轉(zhuǎn)移呈負相關(χ2=9.506,P<0.05),而與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、Ki67表達水平、腫瘤大小(T)及組織學分級等無關(P均>0.05),見表1。

表1 DLG4表達與三陰型乳腺癌患者病理特征相關性

3 討論

三陰型乳腺癌由于ER/PR、ERBB2基因缺失因此得名,由于它對內(nèi)分泌治療和靶向治療不敏感,所以預后相對較差,并且容易在早期出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移等情況。化療一直是臨床上對三陰型乳腺癌的主要一線治療選擇。尋求三陰型乳腺癌的高效治療靶標,實現(xiàn)精準靶向治療,是減少三陰型乳腺癌術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要途徑。

DLG4編碼PSD-95蛋白,其是MAGUK家族的一個成員。它與PSD-93一起被招募到相同的N-甲基-D-天氡氨酸(NMDA)受體和鉀通道群中。有研究表明,Syntenin是癌細胞轉(zhuǎn)移中的主要蛋白質(zhì),已被確定為外泌體生物行為中的關鍵參與者,該蛋白包括4個功能區(qū):N末端、DLG4、PDZ1、PDZ2和 CTD。相關分子研究結果表明,PDZ結構域位于細胞內(nèi)或質(zhì)膜中,并與伴侶蛋白的C端肽結合。在乳腺癌中,syntenin-1過度表達[11-13],導致乳腺癌發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[14]。通過miRNA上調(diào)或下調(diào)表達來干預乳腺癌的遷移和侵襲能力,因而在治療過程中選擇相應的基因作為靶點,對其進行針對性的調(diào)節(jié)可起到更好的治療效果,這也是在針對腫瘤生物學行為對其進行靶向干預研究領域中的重要方向[15]。

外泌體作為一種新型的胞外囊泡,在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的作用[16]。本研究在三陰型乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者外泌體中篩選差異表達基因,并將PSD-95(DLG4)做為本研究中一個具有顯著差異性的mRNA,通過KEGG和GO富集分析發(fā)現(xiàn)其可能參與NIK/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié),而該信號通路對乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移會產(chǎn)生一定促進作用[17],由此推測PSD-95(DLG4)可能通過調(diào)控或干預該信號通路來影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結果表明,PSD-95(DLG4)低表達可能影響三陰型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,并且PSD-95(DLG4)低表達與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關。因此,盡早了解和此類患者淋巴結轉(zhuǎn)移情況有助于制定更加精準的治療方案。PSD-95(DLG4)作為編碼RNA,若能在基因?qū)用鎸ζ溥M行早期干預有望降低患者的淋巴結轉(zhuǎn)移風險。由于本研究的樣本例數(shù)較少,因此無法對患者進行生存分析。從數(shù)據(jù)庫分析得出PSD-95(DLG4)可能參與NF-κB通路的調(diào)節(jié),但其參與的具體機制尚不清楚,本課題組今后將對該機制進行進一步研究和探討。