潰瘍性結腸炎動物模型構建方法的研究進展

田家華，索小濤，馬晨曦，鄭麗紅，王海強

1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院消化二科，哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫藥大學附屬第四醫院消化內科

潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病理改變主要累及結腸或直腸的黏膜層和黏膜下層，臨床表現為黏液膿血便、間斷性腹瀉、腹痛、里急后重等。有研究表明，UC可增加自身免疫性肝病、結直腸癌、貧血等疾病的發生風險，并可引起焦慮、抑郁等精神心理疾病，給患者造成沉重的經濟負擔和巨大的心理壓力［1-3］。目前，UC的確切發病機制尚不完全清楚，可能與腸道微生態失衡、自身免疫功能紊亂以及家族遺傳等因素有關［4］。UC診斷尚無金標準，主要結合臨床表現、影像學檢查、結腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC 病程往往較長，病情遷延難愈，緩解期與活動期交替出現，病例收集和隨訪難度較大。UC動物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態及菌群紊亂情況。因此，通過構建合理的動物模型對揭示UC的發病機制、探索高效的治療策略至關重要。目前，UC動物模型的構建方法主要有誘導法、基因敲除法和聯合法，這些模型構建方法各有利弊，應根據自身實驗需求和實驗條件選擇最適合的動物模型。本文結合文獻就UC動物模型構建方法的研究進展作一綜述。

1 誘導法構建UC動物模型

誘導法是UC 動物模型最常見的建模方法，通常采取口服、灌胃、灌腸三種方式經消化道給藥，部分化學藥物還可采取經腹腔注射方式給藥。誘導法的成本相對較低，對實驗室硬件要求較低，并且建模成功率較為理想。但誘導法對給藥時間、藥物濃度及動物敏感性等要求較高，部分誘導藥物的毒性較強，易造成動物死亡。根據誘導劑不同，誘導法可分為化學藥物誘導法、微生物誘導法和食物誘導法。誘導法UC 動物模型的誘導藥物、給藥方式、常用動物、建模周期及模型評價見表1。

表1 誘導法UC模型的誘導藥物、給藥方式、常用動物、建模周期及模型評價

1.1 化學藥物誘導法 化學藥物誘導法是通過化學藥物、抗原或抗體制劑等破壞腸黏膜屏障并誘導結腸炎癥，是最經典且最常用的UC 動物模型構建方法。最常用的化學藥物為葡聚糖硫酸鈉（DSS），其次為三硝基苯磺酸（TNBS）和乙酸。此外，還有一些使用頻次較低的化學藥物，如二硝基苯胺磺酸（DNBS）、惡唑酮（OXA）、吲哚美辛等。通過DSS 構建UC 動物模型簡單易行，成功率高，可重復性強，可模擬UC 急性和慢性炎癥過程。通過TNBS 構建UC動物模型，低劑量時炎癥維持時間較短且存在自愈傾向，而高劑量時則易引起動物死亡。但該模型構建方法可通過調整藥物劑量模擬UC 活動期與緩解期交替的臨床狀態。乙酸構建UC 動物模型周期短，藥效持續時間有限，僅可誘導UC 急性炎癥過程。DNBS 的藥理特征與TNBS 類似，但需配合乙酸使用，建模較復雜，近年越來越少通過DNBS 構建UC 動物模型。OXA 與DNBS 同為半抗原，無法單獨應用，需預先配合乙醇致敏，通過OXA 構建UC 動物模型亦逐年減少。吲哚美辛可抑制腸黏膜中前列腺素合成，進而損傷腸黏膜屏障，但該藥制備時操作繁瑣，并且損傷部位更趨向于小腸，近年已逐漸被棄用。化學藥物誘導法一般需要先將實驗動物置于光照12 h/黑暗12 h交替、適宜的溫度和濕度環境下適應性飼養1 周，然后制備相應濃度的化學藥物進行口服、灌胃、灌腸或腹腔注射。根據模擬的臨床分期不同，化學藥物誘導法建模所需時間由1 周至數月不等［5］。各化學藥物的作用機制有所不同，DSS 和乙酸可直接作用于消化道黏膜層及黏膜下層，通過破壞消化道物理屏障的緊密連接結構，為致病菌鞭毛、脂多糖等有毒物質侵襲結腸組織創造條件，還可影響TNF-α、IL-6 分泌，進而破壞炎癥因子平衡；TNBS、DNBS、OXA則作為抗原通過誘發免疫炎癥反應，模擬UC 患者的腸組織病理變化；吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，可抑制維持腸黏膜屏障的前列腺素分泌，進而造成腸黏膜屏障破壞和腸道炎癥。化學藥物誘導法的適用范圍較廣，既可用于免疫相關性研究，又可用于腸黏膜屏障相關性研究。化學藥物誘導法的建模動物包括小鼠、大鼠、犬、家兔等，建模難度較低，建模成功率高，但由于其主要通過消化道給藥，能夠直接破壞腸黏膜屏障并誘發免疫應答，部分藥物可能還會誘發腸外癥狀，如TNBS 對皮下組織的腐蝕性較強，可影響實驗結果的準確性。盡管目前已有學者提出了實驗動物用藥劑量換算公式，但在實際應用中，化學藥物誘導法構建UC 動物模型過程中仍存在用藥劑量混亂情況，從而對模型構建成功率造成一定影響。

1.2 微生物誘導法 腸道菌群是指腸道內的微生物，對維持腸道正常功能具有重要作用［6］。正常情況下，腸道菌群可與宿主及外部環境建立起動態平衡，一旦腸道菌群紊亂，即可引起宿主多種功能喪失，如黏膜屏障功能喪失、炎癥和免疫功能喪失等，從而誘發多種疾病［7］。當前，腸道菌群與UC 發病的關系尚未完全明確，但普遍認為益生菌作為優勢菌群可抑制致病菌繁殖，同時提供營養物質維護腸黏膜屏障，避免腸道炎癥發生［8］。厚壁菌門及擬桿菌門的主要代謝產物短鏈脂肪酸可為結腸上皮細胞提供60%～70%的能量，是維護腸黏膜屏障的重要能量來源。而梭狀芽孢菌、類桿菌等與UC 發生和病情加重密切相關，在UC 活動期患者腸道中此類菌群豐度明顯增加［9-10］。微生物誘導法是通過灌胃或灌腸方式使致病菌定植于結腸處，從而誘發UC相關癥狀的模型構建方法。微生物誘導法包括從UC 患者糞便中提取致病菌移植誘導和使用單一菌株移植誘導兩種。微生物誘導法普遍適用于各類實驗鼠，可模擬UC 患者的腸道菌群結構。學者們大多選擇移植UC患者腸道菌群來構建其動物模型，建模成功率較高，但出現動物死亡的概率較大，而單一菌株移植建模成功率尚不確定［11］。微生物誘導法構建UC 動物模型存在較大的不確定性，難以明確誘發UC的具體菌屬，故該建模方法有待于進一步優化。

1.3 食物誘導法 特定的飲食習慣與UC 發生有一定相關性。有研究認為，膳食纖維攝入減少和肉類、蛋類以及乳制品類食物攝入增多是當前UC發病率不斷增長的主要原因［12-15］。食物誘導法是通過高糖高脂飲食和增加乙醇攝入量等誘導腸黏膜屏障損傷的UC 動物模型構建方法。THOMAS 等［16］使用麥芽糖混合豬油制作高脂飼料，小鼠自由進食該高脂飼料6周，第6周末予3% DSS，成功構建出UC動物模型。LI等［17］每日將SD大鼠置于濕熱環境中6 h，實驗全程予蜂蜜水、豬油喂養，從第3周起每日灌胃高度白酒，成功模擬出熱帶沿海人群的UC動物模型。該方法構建的UC動物模型較貼近臨床實際情況，可探索飲食結構與UC 發病的相關性。但由于飼養環境和特定食物制備等問題，該模型構建方法主要適用于小型實驗動物，如BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠、Swiss小鼠。食物誘導法構建UC 動物模型的成功率較低，并且不能單獨構建UC 動物模型，通常需要聯合其他UC動物模型構建方法［12］。

2 基因敲除法構建UC動物模型

全基因組關聯研究發現了不少可能與UC 相關染色體上的易感區域及易感基因［18］。基因敲除是20 世紀80 年代末發展起來的一種新型分子生物學技術，是使生物體基因組中的特定基因失活或失效的過程。近年來，修改實驗動物特定基因片段以實現免疫應答或屏障功能失常成為構建UC 動物模型的新手段。基因敲除法構建的動物模型為進一步探索基因異常所致自發性UC 的發病機制提供了可能。根據敲除基因不同，基因敲除法可分為屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。

2.1 屏障蛋白基因敲除法 在UC 發生、發展過程中，腸黏膜屏障結構和功能的維持對機體免疫環境穩態至關重要［19］。屏障蛋白基因敲除法UC 動物模型是通過敲除構成結腸黏膜屏障的蛋白，以構建自發性UC 動物模型。腸黏膜屏障損傷后，其通透性增加，腸道細菌、內毒素、炎癥介質等可通過受損的腸黏膜屏障進入內環境，誘發和（或）加重炎癥反應，從而導致UC 的發生、發展。基因敲除常選擇的屏障蛋白包括帶狀閉合蛋白、咬合蛋白、閉合蛋白等，通過在靶基因中引入突變使其失去功能［20］。基因敲除方法有同源重組、RNA 干擾和CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 是最常用的基因編輯工具，它使用引導RNA 和Cas9 酶在基因組的特定位置引入靶向DNA 斷裂，從而導致基因破壞［21-22］。屏障蛋白基因敲除法構建UC 動物模型的成功率高，在實驗過程中無自愈傾向，可完全模擬UC 的腸組織病理變化，并且損傷位置精準可控，適用于針對閉鎖蛋白、Claudin 蛋白、膜周蛋白家族以及連接黏附分子等靶點的藥物研發，也是未來構建UC 動物模型的主流方法。屏障蛋白基因敲除法理論上適用于所有實驗動物，但由于基因工程技術難度大、成本高，該模型動物主要為小鼠。

2.2 抗炎因子基因敲除法 腸道內炎癥平衡被破壞是UC 的發病機制之一［23］。抗炎因子基因敲除基于CRISPR/Cas9 基因技術平臺，通過內切酶切割雙鏈DNA 導致切割位點移碼突變或片段缺失，造成基因沉默，功能喪失，從而實現基因敲除［24］；這一步驟完成后，炎癥平衡被打破，促進了炎癥反應，從而成功構建了UC 動物模型［25］。抗炎因子基因敲除法是UC動物模型中最適合研究發病機制的建模方法，同時也適用于自發性UC 高發人群的靶向藥物研發。與屏障蛋白基因敲除法類似，該模型動物主要為小鼠，其原因一個是成本高，另一個是抗炎因子基因敲除后，炎癥平衡被破壞，實驗動物存在死亡風險。

3 聯合法構建UC動物模型

聯合法采取兩種及以上方法構建UC 動物模型，常用于補充單一模型構建方法模擬UC 腸組織病理狀態的不足。GE 等［11］通過化學藥物聯合微生物菌群構建的小鼠UC 動物模型，不僅能模擬腸道菌群失調狀態，還能模擬腸道炎癥狀態，此外還解決了單一菌株建模成功率較低的問題。張澤丹等［26］通過化學藥物聯合特殊飲食并模擬特殊環境構建的小鼠UC 模型，能夠模擬UC 患者真實的生活習慣，適用于特定地域或人群的UC 研究。聯合法構建UC動物模型對實驗動物品類要求較低，各品類實驗鼠均可用于構建UC 動物模型。聯合法構建UC 動物模型的根本目的在于進一步縮小實驗室內模擬環境和臨床實際的差異，可廣泛用于發病機制的研究，但聯合法并非多種模型構建方法的簡單堆砌，需要科學合理的前期設計。

綜上所述，UC是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其確切發病機制尚不完全清楚。目前，UC診斷尚無金標準，主要結合臨床表現、影像學檢查、結腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC病程往往較長，病情遷延難愈，緩解期與活動期交替出現，病例收集和隨訪難度較大。而UC動物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態及菌群紊亂情況。因此，通過構建合理的動物模型對揭示UC的發病機制、探索高效的治療策略至關重要。目前，UC動物模型的構建方法主要有誘導法、基因敲除法和聯合法。這些模型構建方法各有利弊，應根據自身實驗需求和實驗條件選擇最適合的動物模型。