基于藥效學優化參花方提取工藝及其治療銀屑病的譜效關系研究

喻 琴,侯 巖,沈翠娥,李星子,陳中建,朱全剛

(上海市皮膚病醫院/上海中藥外用制劑創新工程技術研究中心,上海 200443)

參花方原名中浴1號,是上海市皮膚病醫院中醫科治療銀屑病等炎癥性皮膚病的經驗有效方,臨床應用已逾10年[1-2]。該方由苦參、野菊花、生側柏葉和花椒組成,具有清熱解毒、除濕止癢的功效,針對銀屑病“血分熱毒熾盛,壅于肌表”的主要病因病機,有望成為治療銀屑病的潛在新藥。目前,臨床上使用的參花方制劑是水提制備的洗劑,本院正在積極將其開發制備為使用攜帶方便、穩定性更好的外洗顆粒劑。本課題組前期已經對參花方顆粒劑的安全性進行了系統評價,發現該制劑在臨床使用濃度下安全、無毒,極具開發前景[3]。水提、醇提、水提醇沉為中藥復方經典的提取方法,是影響復方藥效的重要因素[4],但目前尚無研究對參花方提取工藝進行優化;此外,該方質量標準還不完善,其治療銀屑病的藥效學物質基礎也不清晰,這也阻礙了參花方的新藥開發。近年來新藥研究中鼓勵以“療效指標”而非傳統指標“成分的含量”來評價提取工藝優劣[5]。藥效學可以在動物整體水平上研究中藥的作用效果及機制,較有效成分的比較更直觀,相關性更顯著[6]。譜效關系是在中藥指紋圖譜基礎上,與藥效進行有機的結合,旨在闡明中藥發揮藥效的物質基礎[7-8],此類研究主要包括指紋圖譜的獲取、多指標藥效檢測和譜效關系建立。建立中藥譜效關系,將其作為一種評價中藥質量的方法,可以將中藥化學成分與藥效作用結合起來,更全面地反映中藥質量,彌補中藥質量評價體系的不足[9-11]。基于此,本研究依據藥效學優化提取工藝的理念,比較參花方水提、醇提、水提醇沉提取物的藥效,篩選最優提取工藝;并建立不同提取物的指紋圖譜,采用灰色關聯度分析,研究該方指紋圖譜中共有峰(變量組)與抗銀屑病作用(藥效變量組)的譜效關系,闡明其抗銀屑病作用的藥效物質基礎,為參花方質量評價體系的完善及新藥開發提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級BALB/c小鼠42只,雄性,6～8周齡,體重(20±2)g,購自上海杰思捷實驗動物有限公司,動物質量合格證號:20180004030036。動物飼養于上海市皮膚病醫院動物房(溫度22～26 ℃,相對濕度40%～65%)。本實驗經上海市皮膚病醫院倫理委員會批準,倫理批件號:2021-108(動)預。

1.2藥物和試劑 苦參(Sophorae Flavescentis Radix,批號:19050702)、野菊花(Chrysanthemi Indici Flos,批號:19020202)、(生)側柏葉(Cacumen Platycladi,批號:19041914)、花椒(Zanthoxyli Pericarpium,批號:19039801),藥物均購自吳江上海蔡同德堂中藥飲片有限公司,經該公司質量保證部檢驗,質量合格。對照藥:他克莫司軟膏(普特彼,規格:0.1%,批號:056350)。苦參堿對照品(批號:110805-201709)、槐定堿對照品(批號:110784-201706)、蒙花苷對照品(批號:111528-201911)購自中國食品藥品檢定研究院;綠原酸對照品(批號:17113021)、木犀草苷對照品(批號:18083022)購自上海同田生物技術股份有限公司;卡波姆941(批號:B30M9F57255)購自上海源葉生物科技有限公司;咪喹莫特乳膏(規格:3 g/150 mg,批號:40210802)購自四川明欣藥業有限責任公司;三乙醇胺(批號:20191224 )、磷酸(批號:20200612)購自上海凌峰化學試劑有限公司;高效液相用甲醇、乙腈為色譜純,氯仿、乙醇等為分析純,水為屈臣氏蒸餾水。

1.3參花方提取物的制備 ①水提物:按照處方配比稱取復方各味藥材,加6倍量水加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后靜置過夜,取上清液,繼續濃縮適量即為水提物。②醇提物:按照處方配比稱取復方各味藥材,加6倍量70%乙醇加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后靜置過夜,取上清液,繼續濃縮適量(無醇味)即為醇提物。③水提醇沉物:按照處方配比稱取復方各味藥材,加6倍量水加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后添加乙醇至醇含量為70%,靜置過夜,取上清繼續濃縮適量(無醇味)即為水提醇沉物。

1.4干浸膏的制備 將以上3種提取工藝制備的提取物干燥,即得干浸膏,依據投料及產率計算生藥比。

1.5凝膠劑的制備 將提取物制備成1%的卡波姆凝膠劑,外涂給藥,以便進行藥效學研究。制備方法:向上述3種提取物中加適量三乙醇胺調節pH至5～6,加適量卡波姆、純化水,制備成終制劑生藥比為25%的凝膠劑;按上述凝膠劑處方(不含飲片提取物),將三乙醇胺、水、卡波姆制備的空白凝膠劑作為陰性對照。

1.6HPLC指紋圖譜建立方法

1.6.1對照品溶液的制備 取苦參堿、綠原酸、木犀草苷、蒙花苷對照品適量,精密稱定,于同一10 mL的量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,即得混合對照品溶液:苦參堿118 μg/mL、綠原酸105.3 μg/mL、木樨草苷107.3 μg/mL、蒙花苷97 μg/mL。

1.6.2供試品溶液的制備 取不同提取物制備的各3批干浸膏1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱質量,超聲處理45 min,冷卻至室溫,稱質量,用甲醇補足失重,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,續濾液即為供試品溶液。

1.6.3色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),高效液相色譜儀為Waters e2695(美國Waters公司);以乙腈為流動相A、0.1%磷酸水為流動相B,進行梯度洗脫(0～20 min,5%A→15%A;20～50 min,15%A→30%A;50～65 min,30%A→50%A;65～70 min,50%A→60%A;70～80 min,60% A→85% A;80～90 min,85%A→95%A);流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為210 nm,進樣量為20 μL。

1.6.4精密度考察 取水提干浸膏粉末,精密稱定,按照“1.6.2”項下供試品溶液制備方法制樣,按“1.6.3”項下色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖。以苦參堿(即峰1,該峰分離度好、峰面積大且穩定)為參照峰(S),計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.4%,相對峰面積的RSD均小于5.3%,表明儀器精密度良好。

1.6.5穩定性考察 取水提干浸膏粉末,精密稱定,按照“1.6.2”項下供試品溶液制備方法制樣,室溫下放置0,4,8,12,24 h后,按“1.6.3”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖。以1號峰苦參堿為參照,計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.4%,相對峰面積的RSD均小于6.0%,表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

1.6.6重復性考察 取水提干浸膏粉末6份,精密稱定,按照“1.6.2”項下供試品溶液制備方法制樣,按“1.6.3”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖。以1號峰苦參堿為參照,計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.3%,相對峰面積的RSD均小于5.8%,表明該方法重復性良好。

1.7藥效試驗方法 將BALB/C小鼠隨機分為7組,每組6只。空白組不給予任何處理;其他組小鼠采用咪喹莫特誘導銀屑病:造模前采用脫毛膏脫去背部2.5 cm×2.5 cm范圍的背毛,然后每天上午涂抹咪喹莫特乳膏65 mg/只,涂抹面積2 cm×2 cm,連續7 d。造模期間同時每天下午給予治療(除模型組),空白凝膠組涂抹空白凝膠劑,他克莫司組涂抹他克莫司軟膏,參花方水提物組、參花方醇提物組、參花方水提醇沉物組分別涂抹相應的凝膠劑,均50 mg/只。實驗期間,每天測定各組小鼠體重,觀察小鼠皮損變化情況。第8天,參考文獻[12],依據銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(PASI)評分標準對小鼠病變部位相應紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度進行評分,三者總和即為PASI評分;然后處死小鼠,取皮損皮膚,多聚甲醛固定,石蠟切片,進行HE染色病理學觀察。

1.8統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0進行數據統計分析,數據組間比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1指紋圖譜的生成及相似度評價 參花方按照水提、醇提、水提醇沉工藝各制備3批干浸膏,按照“1.6.2”項下操作,制備成供試品溶液,按“1.6.3”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖。將得到的色譜圖導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)軟件中,以其中1批水提法得到的干浸膏樣品(S1)的圖譜作為參照指紋圖譜(R),計算得到參花方不同工藝提取物的相似度≥0.922,相似度結果見表1,總體上樣品之前質量相對穩定;不同工藝提取物的HPLC圖整體峰形一致,共有18個色譜峰是共有的,確定它們為共有指紋峰,疊加圖譜見圖1。

圖1 參花方水提物(S1～S3)、醇提物(S4～S6)及水提醇沉物(S7～S9)HPLC指紋圖譜疊加圖譜

表1 參花方水提、醇提、水提醇沉提取物的指紋圖譜相似度評價

2.2共有峰的指認 取“1.6.1”項下混合對照品溶液,按“1.6.3”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖(見圖2)。將對照品圖譜與參花方的疊加圖譜進行比較,即將圖1和圖2進行比對,指認峰1為苦參堿,峰5為綠原酸,峰12為木犀草苷,峰17為蒙花苷4個特征峰。

注:1為苦參堿;5為綠原酸;12為木犀草苷;17為蒙花苷

2.3參花方抗銀屑病的藥效

2.3.1對銀屑病小鼠臨床癥狀的影響 與空白組比較,實驗過程中模型組小鼠體重顯著下降,第3天體重下降至約90%,之后幾天在低位波動;背部皮膚覆蓋厚重鱗屑,顯著增厚隆起,鱗屑下皮膚紅腫,PASI評分高達10.5分,表明銀屑病樣小鼠建模成功。空白凝膠組小鼠皮膚覆蓋厚重鱗屑,增厚明顯,皮損的鱗屑、紅斑、增厚評分及PASI評分與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05),表明空白凝膠不干擾參花方以凝膠劑進行藥效考察。參花方各組及他克莫司組小鼠體重下降趨勢有所緩解,但與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。參花方各組及他克莫司組小鼠皮損的鱗屑、紅斑、增厚評分及PASI評分均明顯低于模型組(P均<0.05),其中參花方水提物組小鼠鱗屑、紅斑、增厚評分及PASI評分降低最明顯,背部鱗屑覆蓋不全,輕微鱗屑,皮損較輕;參花方醇提物組小鼠背部覆蓋中度鱗屑,皮損中度隆起;參花方水提醇沉物組小鼠背部覆蓋大部分鱗屑,皮損中度隆起。見圖3。

圖3 空白組和銀屑病各組小鼠皮損情況、皮損PASI評分及體重變化

2.3.2對銀屑病小鼠皮膚組織形態學的影響 空白組小鼠的皮膚結構完整,表皮無增厚,未見角化過度和角化不全,表皮顆粒層清晰,真皮周圍無炎性細胞浸潤;模型組和空白凝膠組小鼠表皮增厚明顯,存在角質層角化不全及大量炎性細胞浸潤,表皮厚度均明顯高于空白組(P均<0.05),但2組間比較差異無統計學意義(P>0.05);參花方各組及他克莫司組小鼠表皮增厚、角化不全及炎性浸潤均有不同程度的改善,表皮厚度均明顯低于模型組(P均<0.05),其中參花方水提物組皮膚組織病理改變改善最優。見圖4。

圖4 空白組和銀屑病各組小鼠皮膚HE染色表現及表皮厚度比較

2.4基于灰色關聯度的譜效關系

2.4.2灰色關聯度分析 根據“2.4.1”項下處理后的結果,分別計算各母序列與子序列之間的灰色關聯系數的平均值,即灰色關聯度(r)。根據灰色關聯原理可知,隨著關聯度的增大,子序列和母序列之間的相關性也就越強,當關聯度大于0.5時,表示該色譜峰代表的化學成分與藥效指標有關聯性;當關聯度大于0.8時,表示該色譜峰代表的化學成分與藥效指標有較大關聯性。計算得到的關聯性結果見表2～4。參花方的18個共有峰與降低銀屑病藥效指標PASI評分能力的關聯度為0.556 1～0.834 8,其中有16個峰與PASI評分有明顯相關性(關聯度>0.8);共有峰與恢復至正常表皮厚度能力的關聯度為0.461 2～0.911 0,其中有15個峰與表皮厚度有明顯關聯性;以PASI評分和表皮厚度按相同權重比計算而得的綜合藥效指標與各共有峰關聯性結果顯示,有15個峰與藥效有明顯關聯性,相關度為0.824 3～0.862 0,按相關性由大到小排名依次為峰2,9,4,8,11,10,13,3,6,7,16,5(綠原酸),14,15,1(苦參堿)。綜合兩種指標的灰色關聯度分析結果,參花方18個共有峰中有15個在抗銀屑病作用方面具有主要貢獻,且總體關聯性均大于0.8;其余3個共有峰中峰12(木樨草苷)及峰17(蒙花苷)的關聯度大于0.6,峰18的關聯度大于0.5,對銀屑病的治療作用也有關聯性。表明參花方的作用與其組方的4味藥材密切相關,是復方多組分綜合效應的結果。

表2 銀屑病小鼠PASI評分與各特征峰峰面積關聯度

表3 銀屑病小鼠表皮厚度與各特征峰峰面積關聯度

表4 銀屑病小鼠藥效指標與各特征峰峰面積關聯度

3 討 論

參花方是治療銀屑病的有效經驗方,臨床沿用水提工藝制備洗劑供患者藥浴,進行新藥開發還需對其提取工藝進行驗證、對其治療銀屑病的物質基礎進行探索。本研究建立了參花方不同工藝提取物的指紋圖譜,前期對提取物干浸膏供試品制備過程中不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)進行了考察,發現用甲醇作為提取溶劑時,圖譜出峰更為豐富,故選擇甲醇作為干浸膏的提取溶劑;對不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)進行了優化,發現甲醇-水作為流動相體系時基線不平且漂移嚴重,乙腈-水基線較平穩,乙腈-0.1%磷酸溶液基線平穩且出峰更多,故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相體系;在檢測波長選擇過程中,進行紫外全波長(200～400 nm)掃描,掃描結果發現檢測波長為210 nm時出峰最多,信號強,大多數峰的峰面積值較大,故選擇210 nm作為參花方HPLC指紋圖譜的檢測波長。本研究對參花方指紋圖譜的色譜條件、樣品處理、方法學等均進行了詳細的考察,為參花方質量標準提升及新藥開發奠定了基礎。

本研究采用藥效學為導向的提取工藝篩選策略,建立了文獻常用的咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠模型,比較水提、醇提、水提醇沉法的提取物對銀屑病樣皮損的治療作用,證實水提法為最優提取工藝。此外,在參花方不同提取物HPLC指紋圖譜特征峰與其抗銀屑病作用數據量化的基礎上,采用灰色關聯度分析法對參花方不同提取物指紋圖譜特征峰與抗銀屑病作用的貢獻大小進行相關性分析,表明各特征峰與降低PASI評分能力的關聯度均大于0.5,18個共有峰中除峰17、峰18,其余峰與PASI評分關聯度均大于0.8,對抗銀屑病作用均有較大貢獻;在表皮厚度數據中,除18號峰,各特征峰的關聯度亦大于0.5,除峰12、峰17、峰18,其余15個特征峰與表皮厚度關聯度大于0.8,對銀屑病治療作用有較大貢獻;以PASI評分及表皮厚度按相同權重比計算而得的綜合銀屑病藥效數據顯示,18個共有峰均與銀屑病藥效有關聯性,其中15個特征峰的關聯度大于0.8,有明顯關聯性,表明參花方抗銀屑病作用是多種成分共同作用的結果。

中藥復方成分眾多,藥效物質基礎不清晰一直是制約中藥國際化的重要瓶頸之一[14]。傳統研究方法是植化分離法,通過對中藥的提取、分離、解析,明晰其結構,并在此基礎上結合藥理模型對純化后的成分進行相應的藥效驗證[15]。該方法雖然為闡明中藥物質基礎起到了積極的推動作用,但是卻忽略了中藥各成分之間的協同作用,往往導致中藥化學成分越分越細,而細小、微量成分無法發揮中藥整體協同的藥效[16-17]。針對中藥多成分、多靶點、整體調節等特點,建立在中藥指紋圖譜研究基礎上,將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效聯系起來,進而篩選出與藥效密切關聯的成分的理論,即譜效關系學。相比于其他研究方法,譜效關系學不僅高效、經濟、環保,更能體現中醫藥的整體觀理念。本研究對參花方治療銀屑病的化學物質基礎群進行了初步研究,獲得了指紋圖譜中各特征峰所代表的化學成分對體內抗銀屑病作用貢獻的大小順序,為參花方新藥開發的物質基礎研究奠定了基礎。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。