基于銅死亡相關的鐵死亡基因構建預測肝癌患者預后的模型

譚天華,宋京海

(1. 中國醫學科學院/北京協和醫學院研究生院,北京 100730;2. 北京醫院/國家老年醫學中心/中國醫學科學院老年醫學研究院,北京100730)

肝細胞癌(簡稱肝癌)是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一,根據世界衛生組織(WHO)的數據,每年全球有超過80萬人被診斷患有肝癌,而且幾乎相同數量的患者因此喪失生命[1]。肝癌的預后評估、個體化治療策略的制定一直是臨床研究的重點之一[2]。目前,臨床醫生主要依靠臨床特征和病理學指標來判斷肝癌患者的預后,然而這些傳統的預測指標存在一定的局限性,無法做到個體化[3]。因此,尋找新的預測指標和生物標志物來評估肝癌患者的預后風險具有重要意義。鐵死亡是鐵依賴的新型細胞程序性死亡方式,主要進程包括鐵積累、脂質過氧化、修復系統受損,可造成細胞死亡和膜破壞,促進鐵死亡可作為誘發腫瘤細胞死亡的治療手段[4]。鐵死亡在肝癌的發生、發展中發揮重要作用,NRF2、Rb、MT1G等多種基因參與肝癌細胞抵抗索拉非尼誘導的鐵死亡[5]。銅死亡通過銅離子與三羧酸循環的脂質組分結合,促進鐵硫蛋白損傷、脂酰化蛋白聚集,產生毒性應激導致癌細胞死亡[6]。鐵、銅離子具有劑量依賴性細胞毒性,能相互作用共同促進腫瘤細胞死亡[7]。本研究通過構建基于銅死亡相關的鐵死亡基因的模型,評估了其與肝癌患者生存期、免疫功能的關系,以尋找預測肝癌預后的標志物,為臨床研究提供參考。

1 資料和方法

1.1數據來源 使用TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫中的肝癌患者RNA序列轉錄組數據、相關臨床特征數據和突變數據,對轉錄組數據進行了整理,分離出mRNA和LncRNA,并提取了臨床信息和計算腫瘤突變負荷,最終納入370例肝癌患者,按照1∶1的比例將合并后的數據集隨機分為訓練組(即訓練模型數據,通過訓練組的數據確定擬合曲線的參數,185例)和測試組(即測試已經訓練好的模型的精確度,185例)。同時下載driver、Suppressor和Marker三類與鐵死亡相關的基因,合并為鐵死亡相關基因集合。將銅死亡基因和鐵死亡基因與mRNA結合,獲得這些基因相關的表達矩陣。使用R Studio軟件中的limma包,過濾標準為相關系數corFilter=0.3,并設置p值過濾標準為pvalueFilter=0.05,篩選與銅死亡相關基因具有相關性的鐵死亡基因。

1.2模型的構建 使用R Studio軟件中的limma包將與銅死亡相關的鐵死亡基因與肝癌患者的臨床數據合并。基于中位風險評分,建立低風險組、高風險組2個亞組。利用Lasso Cox回歸方法,在TCGA數據集中尋找與肝癌患者生存期顯著相關的銅死亡相關的鐵死亡基因。通過多因素Cox回歸分析銅死亡相關的鐵死亡基因,建立銅死亡相關的鐵死亡基因的風險模型。風險評分的計算公式:風險評分=銅死亡相關的鐵死亡基因1×coef+銅死亡相關的鐵死亡基因2×coef+……+銅死亡相關的鐵死亡基因n×coef,其中coef代表鐵死亡基因與生存期相關的系數。

1.3模型的驗證 繪制風險曲線,觀察高風險組和低風險組的差異。采用單因素和多因素的Cox回歸分析,驗證預后模型是否能夠獨立于肝癌患者的其他臨床特征(如性別、年齡、腫瘤分級和腫瘤分期)來區分預后。繪制ROC曲線和C-index曲線,評估和驗證模型預測肝癌患者生存期的準確性。

1.4基因的功能和免疫相關性分析 選取高風險組和低風險組的具有差異表達的基因進行與免疫功能相關性分析,探索2組中表達顯著差異的免疫功能指標,繪制瀑布圖,比較高風險組和低風險組中基因突變頻率的情況。通過將腫瘤突變負荷與肝癌患者的風險評分結合進行分析,獲得聯合的生存曲線。

1.5統計學方法 運用SPSS 26.0和R 4.0進行數據分析,使用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗進行高低風險組間的生存期比較,運用單因素和多因素Cox回顧分析預測模型對肝癌患者預后的獨立預后價值,繪制ROC曲線評估模型預測肝癌患者生存期的價值,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1風險模型的構建 肝癌患者的生存數據和與銅死亡相關的鐵死亡基因(見圖1)合并后獲得13個與銅死亡相關的基因,提取13個基因在肝癌患者中的表達量。運用Lasso回歸分析與銅死亡相關的預后基因,并構建Cox模型。在多變量Cox回歸數據中選擇EIF2S1、G6PD和NRAS這3個與銅死亡相關的鐵死亡基因進一步分析,結果顯示訓練組中EIF2S1、G6PD、NRAS與生存期獨立相關(P均<0.05),可構建風險模型以評估肝癌患者的預后風險。根據多變量Cox回歸分析得出的預后模型公式如下:風險評分=(0.594 652 370 045 789×EIF2S1表達)+(0.205 764 004 842 305×G6PD表達)+(0.369 015 871 232 048×NRAS表達)。

圖1 肝癌與銅死亡基因相關的鐵死亡基因的表達情況

2.2模型的驗證 Kaplan-Meier分析顯示,與低風險組比較,高風險組患者的生存期較短(P<0.05),生存率較低(P<0.05),見圖2。單因素Cox回歸分析顯示,銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型HR為1.734,95% CI為1.494～2.034,P<0.001,見圖3。多因素Cox回歸分析顯示,銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型HR為1.661,95% CI為1.397～1.976,P<0.001,見圖4。ROC曲線分析發現,風險模型預測肝癌患者第1,3,5年生存期的曲線下面積(AUC)分別為0.760,0.663和0.636,AUC均大于0.5,說明該模型對預測肝癌患者的生存期具有較高的準確性,見圖5。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,與早期肝癌患者相比,晚期肝癌患者生存期更短(P<0.05),生存率更低(P<0.05),見圖6。

圖2 高低風險肝癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

圖3 單因素Cox回歸分析銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型對肝癌生存期的預測價值

圖4 多因素Cox回歸分析銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型對肝癌生存期的預測價值

圖5 ROC曲線分析銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型對肝癌生存期的預測價值

圖6 早期和晚期肝癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

2.3基因功能和免疫相關性 在高風險組和低風險組中,Type Ⅱ IFN Response、Parainflammation、APC co-stimulation、CCR、Check-point和MHC class Ⅰ這6個免疫功能的表達存在統計學差異(P均<0.05),見圖7。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,高腫瘤突變負荷的肝癌患者生存期明顯短于低腫瘤突變負荷的患者(P<0.05)。見圖8。

圖7 高低風險組患者的免疫功能分析

圖8 高腫瘤突變負荷與低腫瘤突變負荷肝癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

隨著對肝癌細胞學和腫瘤生物學的深入研究,發現銅死亡和鐵死亡途徑在腫瘤發生發展中具有重要作用,為選擇與銅死亡相關的鐵死亡基因作為預后模型的關鍵基因集奠定了理論基礎[8]。本研究通過對TCGA數據庫中獲取的RNA序列轉錄組數據分析顯示,與銅死亡相關的鐵死亡基因的表達與肝癌患者的生存期密切相關;通過Lasso回歸分析和Cox模型的構建,確定了3個銅死亡相關的鐵死亡基因(EIF2S1、G6PD和NRAS)作為預后模型的關鍵基因,在訓練組中被證實與生存期獨立相關,其表達水平與風險評分呈正相關。根據多變量Cox回歸分析得出的預后模型公式,計算每個患者的風險評分,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示高風險組和低風險組患者的生存期存在統計學差異,表明構建的模型能對高低風險肝癌患者的生存期具有一定的預測價值;單因素和多因素Cox回歸分析驗證結果表明銅死亡相關的鐵死亡基因構建的風險模型具有肝癌的獨立預后特征,可以作為評估患者預后風險的重要指標;ROC曲線分析表明,風險模型能夠有效預測肝癌患者的生存期,為臨床決策提供了重要的參考依據;Kaplan-Meier生存曲線分析顯示晚期肝癌患者生存期明顯短于早期肝癌患者,表明風險模型可以準確地預測肝癌患者不同臨床階段的生存期,有助于為不同階段患者的治療提供參考。

免疫功能與肝癌患者預后密切相關,其中Type Ⅱ IFN Response反應與抗病毒免疫有關, Parainflammation反應與慢性炎癥相關,APC co-stimulation參與T細胞的活化和抗原遞呈,CCR與細胞趨化和炎癥反應有關,Check-point影響T細胞調節,MHC class Ⅰ在腫瘤免疫監視中起到重要作用[9-14]。本研究結果發現,在高風險組和低風險組中,Type Ⅱ IFN Response、Parainflammation、APC co-stimulation、CCR、Check-point和MHC class Ⅰ這6個免疫功能指標有統計學差異,表明銅死亡相關的鐵死亡基因可能參與肝癌的免疫功能調節,與肝癌患者的預后密切相關。

腫瘤突變負荷被認為是一個重要的腫瘤特征,與腫瘤進展和預后密切相關[15]。本研究結果發現,高腫瘤突變負荷患者的生存期明顯低于低腫瘤突變負荷的患者,驗證了腫瘤突變負荷對肝癌患者生存期的影響,并為評估患者預后提供了重要的補充信息。

綜上所述,與銅死亡相關的鐵死亡基因在肝癌患者預后、免疫功能和腫瘤突變負荷中有重要作用。本研究為肝癌預后評估提供了一個可靠和準確的模型,該模型基于與銅死亡相關的鐵死亡基因能夠區分不同預后風險的患者,可以用于指導患者的治療選擇和監測,評估不同預后風險患者對特定治療方案的反應以及個體化治療策略的有效性,且為進一步研究銅死亡相關的鐵死亡基因與肝癌免疫治療的關系提供了新的線索,為個體化治療策略的開發提供了新的方向和目標。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。