加味芎蝎散對咳嗽高敏綜合征大鼠神經源性炎癥的影響

孫洮玉,楊 斌,任軍華,樊茂蓉,徐春英,郭慧娟

(1. 北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700;2. 中國中醫科學院西苑醫院,北京 100091)

慢性咳嗽是指時間超過8周,影像學檢查無明顯異常的咳嗽[1]。咳嗽的病因復雜,涉及面廣,治療手段缺乏系統化及精準醫學支持,有相當比例的咳嗽患者經抗生素及鎮咳藥治療后收效甚微,并存在不良反應發生的可能,對患者心理、工作、學習等造成負面影響。咳嗽高敏綜合征是針對慢性咳嗽診治而提出的一個新概念,認為咳嗽并不總是與某種疾病關聯,而是一種具有獨特病理生理學過程的臨床實體,疾病狀況如哮喘、感染、食管反流等多數作為觸發因素,而不是咳嗽的直接原因[2]。咳嗽受延髓呼吸中樞控制,大腦皮質起調節作用,咳嗽反射有自己的神經調節途徑,速激肽網在呼吸道的廣泛存在以及大腦皮質炎癥介質的釋放均是引發咳嗽反射的關鍵因素。氣道的神經源性炎癥是咳嗽高敏綜合征發生的核心機制,氣道上皮及氣道平滑肌細胞表面存在大量速激肽受體,是神經源性介質作用的主要效應細胞,介導氣道血管通透性增強、氣道管腔分泌物增多,分泌炎癥分子;咳嗽反射弧將信號傳入咳嗽中樞,大腦皮質釋放白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質,調節咳嗽反應的發生、持續[3]。加味芎蝎散是徐榮謙教授由傳統古方芎蝎散加減而來,臨床治療咳嗽變異型哮喘療效顯著[4-5]。前期動物實驗也發現,加味芎蝎散可以調節氣道上皮增殖[6]、凋亡[7]、自噬[8]及Th1/Th2比例[9],逆轉氣道平滑肌表型轉化[10],從而抑制咳嗽反應。本實驗通過建立咳嗽高敏綜合征大鼠模型,觀察肺組織速激肽及受體、大腦皮質炎癥介質等的表達變化,探討了加味芎蝎散是否可影響神經源性炎癥,以進一步明確其作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 36只SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g,4～6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2016-0001。普通飼料喂養,自由飲水,保持室溫(22±2)℃、濕度(50±10)%。本實驗通過中國中醫科學院西苑醫院動物實驗倫理研究委員會審核,倫理批準號:2021XLC015-1。

1.2藥物 加味芎蝎散由川芎5 g、全蝎3 g、蘆根20 g、蓽茇1 g、半夏5 g、細辛1 g、五味子10 g、白前10 g組成,所有藥材經北京中醫藥大學東直門醫院孫洮玉副教授鑒定為正品。中藥煎藥機煎制,全蝎炮制入藥,制成含生藥量3.0 g/mL的濃縮液。磷酸可待因片(國藥集團工業有限公司,國藥準字H11020673,規格:30 mg/片)。

1.3試劑及儀器 紅塔山過濾嘴香煙(焦油含量10 mg、尼古丁含量1.0 mg、CO含量10 mg),紅塔煙草集團;P物質(SP)小鼠單克隆抗體(貨號:ab14184)、瞬態電壓感受器陽離子通道(TRPV1)小鼠單克隆抗體(貨號:ab203103)、IL-6小鼠單克隆抗體(貨號:ab9324)、TNF-α小鼠單克隆抗體(貨號:ab220210),英國Abcam公司;降鈣素基因相關肽(CGRP)兔單克隆抗體(貨號:#14959)、IL-1β小鼠單克隆抗體(貨號:#12242),美國CST公司;二抗酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批號:1919D0516),北京中杉金橋生物技術有限公司;TPl020型全自動脫水機、RM2235型組織切片機,德國Leica公司;HI1220烤片機,德國Leica公司;BX53型光學顯微鏡,日本Olymplus公司。

1.4實驗方法 隨機選取6只大鼠作為正常組,剩余大鼠參照文獻[11-12]實驗方法進行咳嗽高敏綜合征造模:每天于固定時間將大鼠放入自制的動物飼養敞箱(長40 cm、寬40 cm、高30 cm),箱子接近頂部同時點燃10支香煙,然后箱子上方蓋上用來封閉的木板,60 min后取出大鼠,該場景用來模擬大鼠的被動吸煙狀態,2次/d,持續2周后抽取大鼠行咳嗽反應檢測,以確定是否造模成功。將造模成功大鼠隨機分成模型組、加味芎蝎散高劑量組、加味芎蝎散中劑量組、加味芎蝎散低劑量組、磷酸可待因組,每組6只。按照大鼠/人體表面積法換算,加味芎蝎散高、中、低劑量組分別給予加味芎蝎散12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、3 g/(kg·d)灌胃,磷酸可待因組給予磷酸可待因10 mg/(kg·d)灌胃,正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,連續灌胃3周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1咳嗽次數 在灌胃1周、2周、3周末,分別將各組大鼠放入密閉箱內,霧化吸入濃度104 mol/L的辣椒素溶液,持續1 min,取出后記錄3 min內的咳嗽次數。

1.5.2肺組織病理形態 末次灌胃結束后,以氯胺酮(3 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,頸椎脫臼法處死,迅速剖取左肺,置入10%中性福爾馬林溶液中固定后,常規脫水、包埋、切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察。

1.5.3大腦皮質神經元細胞存活狀態 取大鼠大腦組織,置入10%中性福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋,4 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精入水,常溫下用0.1%尼氏染色液染色50 min,染色結束后流水洗滌、脫水、透明、封片,顯微鏡觀察神經細胞染色情況(尼氏體是神經元的特征性結構之一,廣泛存在于神經元的胞體和樹突內,與堿性染料結合顯示出藍紫色,能反映細胞的存活狀態)。

1.5.4支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白及大腦皮質中IL-6、IL-1β表達情況 采用免疫組化法檢測:肺組織及腦組織石蠟切片脫蠟至水后,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓修復抗原3 min,10% H2O2室溫封閉10 min,PBS洗滌后加入一抗(濃度分別為1∶300,1∶200,1∶100,1∶200,1∶50,1∶200),用PBS代替一抗做陰性對照,4 ℃冰箱孵育過夜。次日PBS充分洗滌后,加入即用型二抗PV6000,室溫孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色,鏡下觀察目標細胞著色情況,自來水終止反應,充分洗滌后蘇木精復染、鹽酸酒精分化、氨水反藍、梯度酒精脫水、封片。在光學顯微鏡下,每張切片選取3個高倍視野,醫學圖像分析軟件(Image Pro-plus 6.0)分析測定每張圖像的積分光密度值。

2 結 果

2.1各組大鼠咳嗽次數比較 實驗過程中,正常組大鼠的咳嗽次數少且未見明顯波動;模型組大鼠灌胃1周、2周、3周末的咳嗽次數均明顯多于正常組(P均<0.05),且隨時間遷移呈緩慢增多趨勢;加味芎蝎散高、中劑量組及磷酸可待因組大鼠灌胃2周、3周末的咳嗽次數均明顯少于模型組(P均<0.05),此3個給藥組大鼠的咳嗽次數比較差異均無統計學意義(P均>0.05);加味芎蝎散低劑量組大鼠的咳嗽次數有減少,但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠3 min內咳嗽次數比較次)

2.2各組大鼠肺組織病理形態比較 正常組大鼠支氣管黏膜結構正常,上皮細胞未見變性,平滑肌排列有序,未見增厚,管壁未見炎細胞浸潤;模型組大鼠支氣管管腔擴張,黏膜上皮輕度變性,平滑肌層增生且排列無序,管壁充血、水腫,可見大量炎細胞浸潤。與模型組比較,各藥物組病變均有不同程度的減輕,其中加味芎蝎散組高、中劑量組黏膜上皮變性明顯減輕,平滑肌組織排列較有序,炎細胞浸潤減少;加味芎蝎散低劑量組與磷酸可待因組炎性反應明顯減輕,黏膜上皮變性及平滑肌增生改變不明顯。見圖1。

圖1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠肺組織病理形態(HE染色,×200)

2.3各組大鼠大腦皮質神經元細胞存活狀態比較正常組神經元細胞胞體形態正常,排列均勻,胞質豐盈,尼氏體明顯;模型組神經元細胞部分分布稀疏,形態不規則,尼氏體變少;與模型組比較,各藥物組細胞分布較密集,形態較規則,尼氏體增多,以加味芎蝎散組高、中劑量組和磷酸可待因組改善更明顯。見圖2。

圖2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質神經元細胞存活狀態(尼氏染色,×200)

2.4各組大鼠支氣管黏膜組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達情況比較 SP、CGRP、TRPV1陽性表達呈黃色至棕黃色,主要表達在支氣管黏膜上皮細胞胞漿及胞膜,部分間質神經纖維及血管內皮細胞上亦有表達,本次實驗僅統計黏膜上皮部分。模型組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),加味芎蝎散組高、中劑量組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3～5及表2。

圖3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

圖4 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中CGRP蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

圖5 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中TRPV1蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

表2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP、CGRP及TRPV1蛋白表達積分光密度值比較

2.5各組大鼠大腦皮質中IL-6、IL-1β表達情況比較 IL-6、IL-1β表達在神經細胞胞漿,為黃棕色顆粒狀。模型組大鼠大腦皮質中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),各藥物組大鼠大腦皮質中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖6、圖7及表3。

圖6 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質中IL-6表達情況(免疫組化染色,×200)

圖7 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質中IL-1β表達情況(免疫組化染色,×200)

表3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質中IL-6、IL-1β表達積分光密度值比較

3 討 論

咳嗽是呼吸系統重要的防御機制,可以及時清除氣道分泌及呼吸道異物;當其功能失調時,表現為咳嗽不可抗拒的發作,甚至對輕微的環境刺激都產生高敏反應。咳嗽已經成為全球普遍存在的醫學問題,亞太國家的一項調查顯示,約10%的成年人被咳嗽困擾,老年人所占比重較大[13]。一項針對老年人的調查發現,慢性持續性咳嗽對精神健康的影響與中風或帕金森病相當[14]。盡管對慢性咳嗽有細致的診療方案,但仍有12%～42%的患者無法解釋病因或難以治愈。此外,缺乏有效和安全的治療咳嗽藥物,歐洲進行的一項調查研究顯示,慢性咳嗽患者止咳藥治療有效率僅為57%,而無效率達到36%[15],這一數據也說明在治療咳嗽方面需要尋求更為有效的治療藥物和治療策略。

咳嗽高敏綜合征概念來源于2014年7月在倫敦舉行的第八屆國際咳嗽會議。傳統觀點認為,咳嗽依托于疾病,通常與其病因密切相關。而咳嗽高敏綜合征概念的基礎是咳嗽神經通路,認為疾病僅僅起到觸發作用,而不是咳嗽的直接原因,強調咳嗽反射通過外周神經和中樞神經共同調控保持平衡,外周刺激信號主要通過迷走神經介導,而大腦中樞在咳嗽反射調控過程中發揮著更重要的作用[16]。

辣椒素是辣椒的有效成分,可引起機體疼痛、燒灼感以及咳嗽,研究中一般作為咳嗽的誘發劑。TRPV1是辣椒素的受體,廣泛存在于氣道壁感覺神經元、氣道平滑肌和支氣管黏膜上皮細胞中,其在慢性咳嗽患者中表達增加[17]。最近的一項臨床試驗探討了TRPV1拮抗劑SB-705498對辣椒素誘導咳嗽反應的影響,發現盡管TRPV1拮抗劑可以降低咳嗽反射對辣椒素的敏感性,但是24 h咳嗽次數、患者自評咳嗽嚴重程度、咳嗽沖動和咳嗽特異性生活質量相對于安慰劑組未見明顯差異[18]。神經源性炎癥過程需要神經遞質介導,SP和CGRP是具有多種生物活性的速激肽,二者可通過刺激感覺神經末梢介導神經源性炎癥發生,引起鈣內流、支氣管平滑肌收縮、氣道上皮損傷、黏液分泌及血管通透性增加、血漿滲出等多種生物學表現[19-20]。白細胞介素參與機體的炎癥反應、信息傳遞、免疫細胞激活以及介導淋巴細胞增殖和分化等多種作用,IL-6和IL-1β是白細胞介素家族中介導中樞神經炎癥的主要促炎分子,據研究多種中藥或其有效成分可降低IL-6、IL-1β水平,增加皮質神經元數量,減輕神經損傷[21-23]。本實驗結果顯示,模型組大鼠出現了病理組織結構性損傷,上皮變性,平滑肌層增生、紊亂,且伴有炎細胞浸潤等;大腦皮質神經元細胞中尼氏體變少;支氣管黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質中IL-6、IL-1β表達上調。提示煙熏建立的咳嗽高敏綜合征模型可引發腦組織的功能性損傷,這可能與神經炎癥有關,但目前未見到有關咳嗽與腦組織關系的報道,其深層機制有待進一步探索。

中醫學認為咳嗽屬于“久咳”“頑咳”范疇。《黃帝內經》提出“五臟六腑皆令人咳,非獨肺也”,認為咳嗽作為癥狀,與其他臟器的功能障礙有密切聯系。中醫既往對咳嗽辨證分型較多,現刪繁就簡,一般分為外感咳嗽和內傷咳嗽兩大類,其病因病機多為外邪所傷,臟腑虛損等而致祛邪不盡,留伏于內,成為伏邪,復因外邪引動,內外合邪,肺氣上逆而作咳嗽[24]。芎蝎散源自宋代陳文中《小兒病源方論》的家傳累世名方,原方為川芎、蓽茇各1兩,蝎稍去毒尖1錢,細辛、半夏各2錢。加味芎蝎散是在前人基礎上加白前、五味子、蘆根等藥而成方,方中川芎活血行氣、祛風止咳;全蝎搜風通絡,以散肺風;配合細辛、蓽茇、半夏溫肺化痰止咳;白前降氣止咳;五味子斂肺止咳;蘆根清肺止咳。該方在臨床使用中療效確切,不良反應率低。本實驗結果顯示,與模型組比較,加味芎蝎散高、中劑量組大鼠咳嗽次數明顯減少,病理變化均有不同程度的減輕,支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯降低。證實加味芎蝎散方可以減少咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽次數,減輕肺組織炎癥,保護腦神經元,下調神經源性炎癥因子表達。

綜上所述,加味芎蝎散方可以抑制咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽反射,減輕肺組織和腦神經元損傷,其作用機制可能與抑制神經源性炎癥有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。