蟾酥誘發人成骨肉瘤MG-63細胞凋亡的作用機制研究

卞泗善,蘇慶紅,秦 燕,滕加文,趙新芝

(1. 山東中醫藥大學附屬醫院,山東 濟南 250014;2. 山東第一醫科大學,山東 濟南 250000;3. 濟南市中西醫結合醫院,山東 濟南 271100;4. 山東省中醫藥研究院,山東 濟南 250014)

骨肉瘤是臨床常見的骨惡性腫瘤,惡性增殖的肉瘤細胞可產生腫瘤性骨樣組織或不成熟骨,甚至腫瘤可穿過骨骺侵犯關節,預后多較差。目前關于骨肉瘤發生及進展的具體機制尚不十分清楚,西醫主要采用手術、化療、放療相結合的綜合療法治療,其中約有30%的患者對化療藥物不敏感[1],截肢治療后的3～5年存活率僅為5%～20%[2],而且放化療過程中存在著嚴重的胃腸道反應、骨髓抑制、心肌損害等不良反應。目前中藥治療骨肉瘤的臨床效果得到廣泛認可,主要體現在控制病情、提高免疫、增效減毒、控制術后復發等方面。蟾酥具有解毒去積的功效,其有效成分具有廣譜抗癌活性[3-4]。既往實驗研究發現,蟾酥可以調控人骨肉瘤細胞的凋亡、遷移及侵襲[5-6],但作用機制有待明確?；诖?本研究探討了不同濃度的蟾酥對人成骨肉瘤MG-63細胞的影響及其可能的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 30只SPF級雄性C57BL/6J小鼠,鼠齡6～8周,體重(20±3)g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物許可證號:SCXK[魯]20190003。小鼠飼養在山東中醫大學動物實驗中心,每籠4～6只,使用SPF級墊料(山東中醫大學動物實驗中心提供),每2 d更換1次墊料;保持環境溫度(21±1)℃,相對濕度(50±5)%,明暗時間為12/12,自由獲取飲用水(自來水沸騰后常溫冷卻水)和標準飼料(11.5%的脂肪、20.8%的蛋白質和67.7%的碳水化合物,魯抗,濟寧) ,適應性喂養1周。動物處置符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2實驗細胞、藥物及主要試劑和儀器 人骨肉瘤細胞系MG-63(中科院上海細胞庫),DMEM培養液(美國HyClone公司);蟾酥水溶液(山東中醫藥大學附屬醫院中心實驗室提供,貨號:20170601;1 g蟾酥里含蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量是6.8%,即為0.068 g);特級胎牛血清(以色列BI公司); CCK-8溶液(南京諾唯贊醫療科技有限公司,批號:A311-02-AA);結晶紫染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:G1014);膜聯蛋白V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊醫療科技有限公司,批號:A211-02),胰酶細胞消化液(春仕生物科技有限公司,批號:BL512A);整合素α4(Integrin α4,武漢三鷹生物有限公司,批號:19676-1-AP,1∶200);抗狂犬病IgG Fab2 Alexa Fluor?488分子探針(美國CST公司,批號:4412S,1∶100);堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號:P0321S);鈣鹽染色液(改良茜素紅S法)(北京索萊寶科技有限公司,批號:G3280);多功能酶標儀(美國BIO-RAD公司);顯微鏡(日本尼康公司);Transwell 小室(美國康寧公司);流式細胞儀(美國BD公司);研究級正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3含藥血清制備方法 將30只C57 BL/ 6J小鼠隨機分為3組,每組10只。蟾酥低劑量組給予100 μg/mL濃度蟾酥水溶液灌胃,蟾酥高劑量組給予200 μg/mL濃度蟾酥水溶液灌胃,空白組給予生理鹽水灌胃,灌胃量均為6 mL/kg,2次/d,連續灌胃7 d。末次灌胃2 h后,腹主動脈采血,無菌分離血清,滅活后-20 ℃保存備用。

1.4MG-63細胞培養及傳代 將細胞小心從-80 ℃冰箱取出,放入37 ℃水浴鍋中,使細胞在1～2 min內完全解凍后轉移至T25細胞培養瓶,4～5 h后換液,將細胞懸液轉移至15 mL離心管中,封好口后,室溫1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養基重懸,轉移至2-3皿100 mm細胞培養皿。

1.5檢測指標及方法

1.5.1細胞增殖情況 實驗分為對照組、2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組,每組設3個復孔。將MG-63細胞按3×103個/孔接種于96孔板上,每孔加入200 μL培養液,接種后8 h細胞完全貼壁,將培養液換成不含血清的基礎培養基培養24 h。然后2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應濃度的蟾酥含藥血清,對照組加入等體積PBS。分別于培養24 h、48 h、72 h后,于檢測板的所有復孔預留100 μL的培養液,每孔直接加入10μL的CCK-8,放回培養箱中原條件孵育4 h。之后棄去上清,每孔加入100 μL 10%的 SDS,37 ℃過夜培養。酶標儀檢測各孔570 nm處吸光度,記錄各組OD值。實驗重復3次。

1.5.2細胞凋亡情況 將對數生長期細胞消化、離心和重懸后,以每孔(15～20)×104個細胞的密度接種于6孔板。實驗分3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應濃度的蟾酥含藥血清,對照組加入等體積PBS,待處理結束后收集細胞,將細胞懸液收集至EP管中,1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養基重懸,轉移至2-3皿100 mm細胞培養皿。離心5 min,棄上清。用預冷的PBS清洗細胞2次,1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養基重懸,轉移至2-3皿100 mm細胞培養皿,離心5 min。加入300 μL 1×Bind buffer重懸(Bind buffer 現用現配),加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI,避光室溫孵育15 min。每管加入500～600 μL Bind buffer重懸,在1 h內進行上機檢測。

1.5.3細胞分化情況 以PNPP法檢測細胞中ALP活性。細胞按2×104個/孔接種于24孔板,24 h細胞周期同步后更換新鮮誘導培養液。實驗分3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應濃度的蟾酥含藥血清,對照組加入等體積PBS,每組均設3個復孔,每3 d換液1次,并補加刺激,繼續培養9 d后,吸棄培養液,加入1% TritonX-100溶液200 μL,置4 ℃冰箱中放置1 h以裂解細胞,離心取上清,按ALP檢測試劑盒及蛋白定量檢測試劑盒分別測定ALP活性和蛋白含量,以IU/g蛋白質表示ALP活性,結果與對照組比較。

1.5.4細胞成骨情況 將MG-63細胞消化下來,鋪板于24孔板中,每孔加入500 μL 10%FBS培養基,于37 ℃、5% CO2孵箱培養。待細胞增殖至融合度70%～80%時,按照“1.5.1”分組處理細胞48 h,棄掉原有培養基,加入4%成骨分化誘導液,誘導成骨分化21d,棄掉成骨分化培養基,分別加1 mL PBS潤洗小室2～3次,加500 μL 4%多聚甲醛室溫避光固定細胞30 min,回收多余的多聚甲醛,分別加1 mL PBS潤洗小室2～3次,晾干小室。加入300 μL茜素紅,室溫孵育30 min,棄掉茜素紅,分別加1 mL PBS潤洗小室2～3次,晾干小室于顯微鏡下拍照保存。

1.5.5細胞侵襲轉移情況 取預冷24 h的Transwell培養板,將30 μL MatrigelTM人工基質膠(無血清培養基按1∶3配置)鋪在Transwell裝置的上室并靜置3 h。取對數生長期的MG-63細胞2×105個/mL,置于上室的膠層上。在24孔板下室加入10%胎牛血清+RPMI 1640培養液500 μL。提前用無血清培養基、2.5%蟾酥含藥血清、5%蟾酥含藥血清提前處理MG-63細胞24 h。于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養24 h,然后用PBS液沖洗膠層,室溫下用95%甲醇固定15 min,用結晶紫染色15 min。 高倍鏡(200×)下隨機對5個視野的細胞進行連續計數,取均值。實驗重復3次。

1.5.6細胞中Integrin α 4表達情況 采用流式細胞儀技術定量檢測:重懸貼壁培養的MG-63細胞,400目篩網去除細胞團塊后均分成3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應濃度的蟾酥含藥血清,對照組加入等體積PBS,每組做3個復孔,繼續培養24～72 h。以P4G9和陰性對照CBL600(1∶300)為一抗,羊抗鼠熒光素交聯IgG(1∶1000)為二抗。冰上常規細胞免疫染色標記30 min,1 g/mL碘化丙啶對抗染色15 min,上機檢測Integrin α4表達情況。

2 結 果

2.1各組人骨肉瘤MG-63細胞增殖情況 不同濃度蟾酥含藥血清組各時間點細胞增殖率均明顯低于同期對照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組各時間點細胞增殖率均明顯低于同期2.5%蟾酥含藥血清組(P均<0.05)。見表1。

表1 對照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細胞增殖情況比較

2.2各組人骨肉瘤MG-63細胞凋亡情況 對照組、2.5%蟾酥含藥血清組、5%蟾酥含藥血清組細胞凋亡率分別為(4.95±0.21)%、(8.23±0.28)%、(14.65±0.25)%,不同濃度蟾酥含藥血清組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組細胞凋亡率明顯高于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。見圖1。

圖1 對照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細胞凋亡情況

2.3各組人骨肉瘤MG-63細胞分化和成骨能力比較 對照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組ALP活性分別為(110.32±2.21)IU/g、(132.18±3.51)IU/g、(167.65±5.11)IU/g,不同濃度蟾酥含藥血清組ALP活性均明顯高于對照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組明顯高于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。茜素紅染色顯示,與對照組相比,不同濃度含藥血清組有橘紅色結節、邊界清楚細胞增多,見圖2。

圖2 對照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細胞茜素紅染色情況(×100)

2.4各組人骨肉瘤MG-63細胞侵襲和轉移情況比較 對照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組侵襲性細胞數量分別為(230.21±14.25)個/mL、(192.54±16.51)個/mL、(137.78±15.26)個/mL,轉移性細胞數量分別為(320.56±15.05)個/mL、(272.62±14.78)個/mL、(201.63±15.32)個/mL,不同濃度蟾酥含藥血清組侵襲性細胞和轉移性細胞數量均明顯少于對照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組均明顯少于2.5%蟾酥含藥血清組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細胞侵襲和轉移情況(×200)

2.5各組人骨肉瘤MG-63細胞中Integrin α4表達情況 對照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組細胞中Integrin α4表達占比分別為(53.23±4.23)%、(43.19±3.76)%、(26.45±3.07)%,不同濃度蟾酥含藥血清組Integrin α4表達占比均明顯低于對照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組明顯低于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。見圖4。

圖4 對照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細胞中Integrin α4表達情況

3 討 論

隨著醫學技術的飛速發展,新型輔助化療療法的出現,骨肉瘤患者的5年總生存率有明顯提高,但耐藥性和不良反應明顯使骨肉瘤的治療仍處于困境,例如甲氨蝶呤、順鉑等藥物帶來較好臨床效果的同時,其耐藥性及所帶來的消化系統功能紊亂、免疫失衡,大大降低了患者的生活質量。中藥可通過多靶點、多通路發揮協同作用,可用于各個時期骨肉瘤的治療,而且這些優勢隨著研究的不斷深入逐漸顯露出來。腫瘤藥物的耐藥性是腫瘤患者化療失敗的主要原因,探索腫瘤藥物的多藥耐藥的機制,尋找低毒有效、逆轉耐藥的中藥已然成為國內外研究的熱點。

骨肉瘤具有復雜的核型畸變,如染色體重排、易位、擴增和缺失等[7]。骨肉瘤細胞是一類具有多種成骨細胞表型特征的特殊腫瘤細胞,是成骨細胞分化為成熟骨細胞階段的過渡中間體[8],具有無限增殖、可發生上皮間質細胞轉化和易轉移的特點[9]。相關研究發現,骨肉瘤細胞增殖受到各種分子信號調控,其中癌基因c-Myc是一種可使細胞無限增殖的關鍵基因[10],還可以誘導人成骨肉瘤細胞的分化[11]。整合素是細胞膜上的跨膜黏附蛋白,與惡性腫瘤的侵襲轉移密切相關,其中Integrin α4可誘導MG-63細胞的惡性轉移[12]。

蟾酥具有明顯抗腫瘤作用,其單體化合物如脂蟾毒配基、華蟾毒素、蟾毒靈、遠華嶋毒靈、蟾毒它靈、沙蟾毒精、華蟾毒它靈等對腫瘤細胞有較強的生長抑制作用[13-15]。牛天力[16]研究報道,華蟾酥毒基能在體外明顯抑制多西他賽耐藥的人激素非依賴性前列腺癌PC3細胞生長,并有誘導細胞凋亡的效果。趙迪等[6]實驗研究顯示,華蟾素毒基與順鉑聯用可更有效抑制人骨肉瘤U2OS細胞增殖,誘導其凋亡。

本實驗發現,不同濃度的蟾酥均可以促進MG-63細胞凋亡,改善細胞分化和成骨功能,抑制其侵襲和轉移,下調Integrin α4表達,這種作用尤以5%濃度最為明顯,提示蟾酥可以通過下調MG-63細胞中的Integrin α4表達抑制細胞侵襲和轉移。但蟾酥有效成分頗為復雜,其所帶有的毒性也大大限制了其臨床應用,故尋找中藥提純方法,使抗腫瘤活性成分與毒性成分高度分離是今后的課題研究方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。