射干麻黃湯對支氣管哮喘大鼠巨噬細胞活化及IL-21/STAT3通路調節作用研究

張鳳凱,張宏麗,楊衛立

(1. 珠海市中西醫結合醫院,廣東 珠海 519000;2. 珠海市香灣社區衛生服務中心,廣東 珠海 519000)

支氣管哮喘以慢性氣道炎癥及氣道高反應性為主要臨床特征,其發生與個體過敏體質等遺傳因素、塵螨及空氣污染等環境因素、病原體導致的呼吸系統感染等因素密切相關,且巨噬細胞活化與支氣管哮喘的進展有關[1-3]。近年研究發現,白細胞介素(IL)-21/信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)通路是與支氣管哮喘發生發展密切相關的重要信號通路,該通路的異常激活是導致支氣管哮喘發生及進展的關鍵因素[4]。目前西醫主要采用糖皮質激素及β2受體激動劑治療該病,但長期使用有一定不良反應,有些患者病情控制不滿意,而中西醫結合治療支氣管哮喘顯示出一定優勢。射干麻黃湯是經典名方,具有下氣祛痰、溫肺化飲之功效,既往實驗證實該方可以通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-17的表達,減輕炎癥反應,從而緩解哮喘大鼠氣道重塑[5]。本實驗基于巨噬細胞活化和IL-21/STAT3通路進一步探討了射干麻黃湯治療支氣管哮喘的作用機制,以為射干麻黃湯的臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠36只,6～8周齡,體重200～220 g,購自珠海百試通生物科技有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(粵)2020-0051。大鼠飼養于實驗動物房,溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%,明暗交替/12 h。實驗動物的使用經珠海市中西醫結合醫院倫理委員會審查并批準(倫理審批號:20220114034)

1.2藥品 射干麻黃湯由射干(批號:210913)9 g、細辛(批號:220810)9 g、紫菀(批號:220325)9 g、款冬花(批號:211029)9 g、麻黃(批號:210918)12 g、五味子(批號:220420)12 g、生姜(批號:210716)12 g、半夏(批號:211115)12 g、大棗(批號:220525)15 g組成,中藥飲片購自北京同仁堂藥業公司,將飲片置于1 500 mL蒸餾水中浸泡1 h,煎煮40 min,過濾,留濾液,將藥材殘渣置于1 000 mL蒸餾水中再次煎煮30 min,過濾,留濾液,合并兩次濾液,加熱蒸發濃縮,制成生藥含量為0.5 g/mL的制劑備用。地塞米松片為天津力生制藥股份有限公司產品,批號:210911。卵清白蛋白(OVA)致敏液由1 mL生理鹽水、10 mg OVA(翌圣生物科技股份有限公司,貨號:36121ES60)100 mg氫氧化鋁(北京索萊寶科技有限公司,貨號:A7130)配置而成。

1.3試劑及儀器設備 干擾素-γ(IFN-γ)ELISA試劑盒(北京孚博生物科技有限公司,貨號:EIA4583) ,IL-2 、IL-4、IL-13 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號分別為PI577,PI615,ER0034) ,HE染色試劑盒、山羊抗兔二抗、F4/80兔單克隆抗體、免疫組化試劑盒(碧云天生物科技有限公司,貨號分別為C0105S,A0277,AG4753,P0625); Diff-quick染液(上海鈺博生物科技有限公司,貨號:ES60);組織裂解液、化學發光液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、蛋白含量測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號分別為R0010,PE0010,P1020,PC0020);GAPDH、IL-21、p-STAT3、STAT3兔抗體(賽默飛世爾科技公司,貨號分別為PA1-988,PA5-115407,MA5-41116,PA5-17876)。V100呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司),Gel Doc EZ凝膠成像儀(伯樂生命醫學產品有限公司),Allegra X-15R臺式冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司),M2e酶標儀(美谷分子儀器有限公司),DM IRB熒光倒置顯微鏡(徠卡顯微系統公司)。

1.4實驗方法 隨機選取6只大鼠作為正常組,其余大鼠參照文獻[6]方法使用OVA建立支氣管哮喘模型:于造模開始第1天及第8天腹腔注射OVA致敏液,造模第15天將大鼠置于密閉容器內霧化吸入1% OVA溶液,30 min/次,隔天1次,連續吸入56 d后,以大鼠出現呼吸急促、撓鼻、鼻腔透明分泌物、點頭樣呼吸視為造模成功。將造模成功大鼠隨機分為哮喘組、地塞米松組及射干麻黃湯低、中、高劑量組,每組6只。 射干麻黃湯低、中、高劑量組大鼠分別給予射干麻黃湯1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg(參考文獻[5]計算給藥劑量,以生藥含量計)灌胃,地塞米松組大鼠給予地塞米松1 mg/kg(參考文獻[7]計算給藥劑量)灌胃,正常組及哮喘組灌胃等量蒸餾水,均1次/d,連續灌胃20 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1肺功能 末次灌胃結束后24 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定后行氣管切開并連接呼吸機,使用肺功能檢測系統測定肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速。

1.5.2肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平 肺功能測定結束后行氣管插管,使用4 ℃預冷的PBS 1 mL灌洗大鼠雙肺,收集肺泡灌洗液,每只大鼠重復3次。將肺泡灌洗液置于離心機,4 ℃下3 500 r/min離心10 min, 取上清,使用ELISA試劑盒測定IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平。

1.5.3肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比 收集肺泡灌洗液離心后的沉淀物,使用Diff-quick染液染色后置于光學顯微鏡下觀察,計算嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比。

1.5.4肺組織病理學形態 頸椎脫臼法處死大鼠后分離肺組織,置于4%中性甲醛中固定24 h,石蠟包埋后制成4 μm切片,常規HE染色后,置于顯微鏡下觀察拍照。

1.5.5肺組織中F4/80蛋白陽性表達情況 采用免疫組化法檢測:取制備好的肺組織石蠟切片,經脫蠟、水化后,封閉內源性過氧化物酶及抗原修復后,按照免疫組化試劑盒方法,使用F4/80兔單克隆抗體(1∶500稀釋)室溫孵育1 h,使用PBS清洗5次,加入生物素標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋),37 ℃孵育30 min,PBS清洗5次,DAB著色后,使用蘇木精復染,依次經脫水、透明處理,中性樹脂封片,置于顯微鏡下拍照,使用Image-pro plus 8.0軟件測定F4/80蛋白陽性表達積分光密度。相對積分光密度=實驗組積分光密度/正常組積分光密度。

1.5.6肺組織中IL-21、p-STAT3、STAT3蛋白表達情況 取低溫保存肺組織,使用組織裂解液裂解勻漿后,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,取上清,使用蛋白含量測定試劑盒測定總蛋白含量,取蛋白含量為40 μg的上清液,依次經電泳分離、轉膜后,使用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入GAPDH、IL-21、p-STAT3、STAT3兔抗體(1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜,PBS清洗3次,使用山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h,PBS清洗3次,化學發光液顯影后,置于凝膠成像系統成像并拍照,以GAPDH為內參,計算IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/ STAT3比值。

2 結 果

2.1各組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速比較 哮喘組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速均明顯低于正常組(P均<0.05);射干麻黃湯各組及地塞米松組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速均明顯高于哮喘組(P均<0.05);射干麻黃湯各組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速隨著射干麻黃湯劑量的增加而逐漸升高,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);射干麻黃湯高劑量組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速與地塞米松組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和哮喘各組大鼠肺活量、肺動態順應性及呼氣峰值流速比較

2.2各組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平比較 與正常組比較,哮喘組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明顯降低(P均<0.05),IL-4、IL-13水平均明顯升高(P均<0.05);與哮喘組比較,射干麻黃湯各組及地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明顯升高(P均<0.05),IL-4、IL-13水平均明顯降低(P均<0.05);射干麻黃湯各組隨著射干麻黃湯劑量的增加,肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平逐漸升高,IL-4、IL-13水平逐漸降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);射干麻黃湯高劑量組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平與地塞米松組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和哮喘各組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平比較

2.3各組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比比較 哮喘組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比均明顯高于正常組(P<0.05);射干麻黃湯各組及地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比均明顯低于哮喘組(P均<0.05);射干麻黃湯各組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比隨著射干麻黃湯劑量的增加而逐漸降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);射干麻黃湯高劑量組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比與地塞米松組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 正常組和哮喘各組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞占比比較

2.4各組大鼠肺組織病理學形態 正常組大鼠肺組織正常;哮喘組大鼠肺組織氣管壁增厚,肺組織炎癥損傷;與哮喘組比較,射干麻黃湯各組及地塞米松組大鼠肺組織病變明顯減輕。見圖1。

圖1 正常組和哮喘各組大鼠肺組織病理學形態(HE, ×200)

2.5各組大鼠肺組織中F4/80蛋白陽性表達情況比較 正常組大鼠肺組織中僅有少量F4/80蛋白表達,哮喘組大鼠肺組織中F4/80蛋白表達明顯增多,哮喘組大鼠F4/80蛋白陽性表達相對積分光密度為27.67±2.52,明顯高于正常組的1.00±0.00(P<0.05); 射干麻黃湯低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中F4/80蛋白表達有所減少,相對積分光密度分別為18.27±0.67,13.67±2.08,3.03±1.06,8.33±1.52,均明顯低于哮喘組(P均<0.05);射干麻黃湯各組大鼠肺組織中F4/80蛋白陽性表達相對積分光密度隨著射干麻黃湯劑量的增加而逐漸降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);射干麻黃湯高劑量組與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組和哮喘各組大鼠肺組織中F4/80蛋白陽性表達情況(免疫組化染色,×200)

2.6各組大鼠肺組織中IL-21、p-STAT3、STAT3蛋白表達情況比較 哮喘組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/STAT3比值均明顯高于正常組(P均<0.05);射干麻黃湯各組及地塞米松組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/STAT3比值均明顯低于哮喘組(P均<0.05);射干麻黃湯各組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/STAT3比值隨著射干麻黃湯劑量的增加而逐漸降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);射干麻黃湯高劑量組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/STAT3比值與地塞米松組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 正常組和哮喘各組大鼠肺組織中IL-21、p-STAT3蛋白表達情況

3 討 論

支氣管哮喘是臨床中常見的呼吸系統疾病,目前尚無法根治。近些年的研究顯示,射干麻黃湯可有效治療該病,如何蕊等[8]研究發現射干麻黃湯能夠顯著緩解支氣管哮喘患者臨床癥狀,減輕機體炎癥反應;王坤等[9]研究發現加味射干麻黃湯能夠改善支氣管哮喘患者的肺功能,減輕炎癥反應,減少哮喘發作;左琳等[10]研究證實,加味射干麻黃湯能夠顯著提高孟魯司特鈉對支氣管哮喘的治療效果,縮短患者氣短、呼吸困難的緩解時間。本實驗結果顯示,射干麻黃湯可明顯改善支氣管哮喘大鼠的肺功能,與臨床研究結果一致。氣道炎癥反應是支氣管哮喘的重要特征,INF-γ、IL-2、IL-4、IL-13等炎癥因子及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞均參與氣道炎癥的發生發展[7,11-13]。管泱等[11]研究證實,降低IL-4水平、升高INF-γ水平能夠顯著促進肺功能的恢復,抑制哮喘發作。孟玲玉等[14]報道,減少嗜酸性粒細胞在肺組織中的浸潤,促進嗜酸性粒細胞凋亡,有利于減輕哮喘大鼠氣道炎性反應。本實驗結果顯示,哮喘大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明顯降低,IL-4、IL-13水平和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞占比均明顯升高,肺組織發生炎性損傷;而射干麻黃湯能夠呈劑量依賴性顯著升高IFN-γ、IL-2水平,降低IL-4、IL-13水平和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞占比,進而抑制支氣管哮喘大鼠氣道炎癥反應,減輕肺組織病變。

巨噬細胞活化與支氣管哮喘患者的肺功能及病情進展密切相關,調節巨噬細胞活化狀態可能是治療支氣管哮喘的有效途徑[15-16]。F4/80蛋白是反映巨噬細胞活化的重要標志物,肖愉簫等[17]研究證實其在咳嗽變異性哮喘小鼠肺組織中表達增加。本實驗中哮喘大鼠肺組織中F4/80蛋白陽性表達相對積分光密度明顯升高,說明支氣管哮喘大鼠發生巨噬細胞活化;射干麻黃湯各組大鼠肺組織中F4/80蛋白陽性表達相對積分光密度明顯降低,提示射干麻黃湯能夠抑制巨噬細胞活化。

IL-21/STAT3通路是近年來研究發現的與支氣管哮喘發生、發展密切相關的重要信號通路。 伍爽等[4]研究表明,哮喘大鼠肺組織中IL-21、p-STAT3蛋白表達明顯上調,而下調二者表達能夠顯著抑制哮喘大鼠氣道炎癥,修復肺組織病變。杜明紅等[18]臨床研究證實,支氣管哮喘患者體內STAT3蛋白表達水平升高,且與氣道炎癥程度呈正相關。王瑩巍等[19]研究證實,抑制哮喘幼鼠肺組織中STAT3蛋白表達能夠明顯減輕氣道炎癥。 本實驗結果顯示,哮喘組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/ STAT3比值均明顯高于正常組,射干麻黃湯各組大鼠肺組織中IL-21蛋白相對表達量及p-STAT3/ STAT3比值均明顯低于哮喘組。提示射干麻黃湯能夠抑制支氣管哮喘大鼠IL-21/STAT3通路激活,進而顯著抑制氣道炎癥反應。

綜上所述,射干麻黃湯可有效改善支氣管哮喘大鼠肺功能,減輕氣道炎癥反應,機制可能與抑制肺組織巨噬細胞活化、調節IL-21/STAT3通路有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。