引導(dǎo)編輯技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

邱梅玉,張雪梅,張 寧,劉明軍

(新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新疆動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830026)

在過(guò)去的十年中,CRISPR/Cas9技術(shù)允許精確靶向基因組位點(diǎn)的修飾是具有變革性的。在真核生物中,當(dāng)不存在修復(fù)模板時(shí)雙鏈斷裂(double strand break, DSB)可能引入錯(cuò)配堿基對(duì)的非同源末端連接修復(fù)(non homologous end joining, NHEJ)途徑對(duì)斷裂位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù),這種修復(fù)會(huì)造成堿基插入或缺失,從而導(dǎo)致該基因編碼蛋白的移碼突變引起基因敲除;而當(dāng)存在修復(fù)模板時(shí),精確的同源重組修復(fù)(homologous recombination repair,HDR)途徑對(duì)斷裂位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)實(shí)現(xiàn)基因敲入或點(diǎn)突變[1]。細(xì)胞傾向于利用 NHEJ 來(lái)修復(fù) DSB,造成 HDR 的效率偏低,因此 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)無(wú)法高效地誘導(dǎo)點(diǎn)突變等編輯類型[2]。此外,通常情況下 NHEJ 和 HDR 兩種修復(fù)途徑同時(shí)存在且相互競(jìng)爭(zhēng),而且 NHEJ 效率比 HDR 高。因此,大多數(shù)編輯結(jié)果通常會(huì)同時(shí)發(fā)生插入或刪除(insertions and deletions, Indels)編輯[3]。

隨著CRISPR/Cas9 技術(shù)的不斷發(fā)展衍生出堿基編輯技術(shù) (base editing) ,通過(guò)將失去切割能力的核酸酶與不同堿基脫氨基酶融合,構(gòu)建胞嘧啶堿基編輯器 (cytosine base editor,CBE) 和腺嘌呤堿基編輯器 (adenine base editor,ABE)。這兩類編輯器能夠在不產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂的前提下在基因靶位點(diǎn)完成 C>T (G>A) 或 A>G (T>C) 的替換,最終實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的堿基編輯。目前堿基編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因治療、動(dòng)物模型構(gòu)建、精準(zhǔn)動(dòng)物育種和基因功能分析等領(lǐng)域[4]。然而,單堿基編輯器會(huì)在高效編輯單堿基的同時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的脫靶突變,并且不能實(shí)現(xiàn)堿基之間的顛換(A-T 或 C-G)[5-6]。

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing,PE)通過(guò)對(duì)靶位點(diǎn)的“搜索”和“替換”,可以實(shí)現(xiàn) 12種堿基之間的任意顛換及小片段的精準(zhǔn)插入和刪除,克服CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的 HDR 效率低和堿基編輯系統(tǒng)不能實(shí)現(xiàn)堿基顛換的弊端,具有明顯的優(yōu)勢(shì)[7-8]。

1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的原理及特點(diǎn)

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)包括 Cas9 切割酶(Cas9 nickase,nCas9)、逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase,RT)和 引導(dǎo) RNA(prime editing guide RNA,pegRNA),其中 nCas9 與 RT 融合在一起。pegRNA 的 3′端又延伸出了一段 RNA 序列,包括引物結(jié)合位點(diǎn)(prime binding site,PBS)序列和含有目標(biāo)編輯序列的RT 模板 (reverse transcriptase template,RT template)[9]。利用 nSpCas9 (H840A)和逆轉(zhuǎn)錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLV RT)融合構(gòu)建引導(dǎo)編輯器(prime editor),由 pegRNA 中 guide RNA 部分引導(dǎo)在人細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)附近形成編輯鏈上的單鏈切口,進(jìn)而通過(guò)pegRNA中的PBS序列引導(dǎo)以含有目標(biāo)編輯序列的逆轉(zhuǎn)錄模板將突變精確導(dǎo)入基因組中(圖1)[10-11]。

圖1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)模式圖(引自[11])Fig.1 Schematic Illustration of Prime Editing, as Proposed by [11]

相較于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過(guò) HDR 途徑引入點(diǎn)突變、插入或刪除,引導(dǎo)編輯系統(tǒng)不依賴 DSB 避免產(chǎn)生過(guò)多的 indels 。堿基編輯系統(tǒng)作用過(guò)程中會(huì)引起鄰近非靶點(diǎn)堿基編輯,而引導(dǎo)編輯系統(tǒng)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄模板產(chǎn)生目標(biāo)突變避免indels的產(chǎn)生。對(duì)PE3 來(lái)說(shuō),雖然另一條 sgRNA 的引入造成indels 的增加,但 indels 的水平大多數(shù)在10%以下[7]。另外,CRISPR/Cas9 和堿基編輯系統(tǒng)均存在sgRNA 依賴性脫靶,堿基編輯系統(tǒng)還存在sgRNA 非依賴性脫靶和RNA 脫靶,而引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在基因組靶位點(diǎn)上引入目標(biāo)編輯過(guò)程中,需要發(fā)生 3 種核酸雜交:靶向區(qū)域 DNA 與 pegRNA 的 spacer 的雜交、靶向區(qū)域 DNA 與 pegRNA 的 PBS 序列的雜交、靶向區(qū)域 DNA 與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雜交,3 種雜交的存在決定引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在理論上很難脫靶[12]。

2 引導(dǎo)編輯的編輯效率優(yōu)化及衍生技術(shù)

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)雖然優(yōu)勢(shì)明顯,但其早期版本的編輯效率均較低,極大限制了其應(yīng)用(表1)。目前,Liu 等[13]在 SpCas9 與 M-MLV 序列的 N 端和 C 端添加 c-Myc NLS 和 SV40 NLS,構(gòu)成PE2*;用 SaCas9 和 SaCas9KKH 變體替換 SpCas9,構(gòu)成 SaPE2*和 SaKKHPE2*編輯效率分別為5.6%～11.3%和1.3%～4.2%。Xu等[14]構(gòu)建 PE-P2,利用自切割多肽 2A 串聯(lián)表達(dá)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)和篩選標(biāo)記,強(qiáng)化sgRNA使水稻基因組中靶位點(diǎn)突變效率從 1.2%提高到 26%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在 RT 模板中引入同義錯(cuò)配堿基和 nCas9 的 C 端融合 M-MLV 均可提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率,結(jié)合使用時(shí)水稻、玉米原生質(zhì)和人細(xì)胞中的平均編輯效率分別達(dá)到 24.3%、6.2%和 12.5%[15]。Lu 等[16]通過(guò)密碼子優(yōu)化和 CaM35 S 啟動(dòng)子優(yōu)化提高PE在番茄中的編輯效率。

表1 引導(dǎo)編輯的衍生技術(shù)Table 1 Technologies derived from prime editing

對(duì) nCas9-MMLV 融合蛋白多個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化(MMLV 的優(yōu)化密碼子、 Cas9n 突變體、Cas9n 與 MMLV 添加連接序列和增加 NLS 序列),構(gòu)建出具有更高編輯效率的 PEmax[17]。

為了進(jìn)一步提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率,Chen等[17]、Zhang等[18]、 Liu等[19]進(jìn)行CRISPR 干擾(CRISPR interference,CRISPRi) 篩選,發(fā)現(xiàn) DNA 錯(cuò)配修復(fù)(DNA mismatch repair,MMR)相關(guān)基因抑制引導(dǎo)編輯的效率,并增加 indels比例。Ferreira Da Silva 等[20]研究表明,通過(guò)消除 MMR,引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率可提高2～17 倍。Jiang 等[21]在引導(dǎo)編輯系統(tǒng)基礎(chǔ)上研發(fā) PE-Cas9-based deletion and repair (PEDAR),精確進(jìn)行1～10 kb片段的刪除和60bp的插入編輯效率為12.5%～22.5%,Choi等[22]設(shè)計(jì)PRIME-Del 編輯系統(tǒng)精確進(jìn)行大于10 kb片段刪除和30bp插入編輯效率為1%～30%。Anzalone 等[23]開發(fā) twin prime editing (twinPE) 編輯系統(tǒng)使用成對(duì)的pegRNA 進(jìn)行780 bp 的刪除、20 bp～1 kb 的插入、整合基因DNA質(zhì)粒>5 kb和 40 kb的目標(biāo)序列倒置,相比PEDAR 和 PRIME-Del 會(huì)產(chǎn)生更少的indels。Wang 等[24]開發(fā) GRANDE diting 系統(tǒng),利用一對(duì)特殊設(shè)計(jì)的 pegRNA 在不同細(xì)胞中編輯實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá) 1 kb DNA 片段的靶向插入編輯效率分別為6.5%～35.2%、11.5%～57.0% 和3.3%～6.5%。

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)pegRNA 的 3′端延伸未被融合蛋白包裹,容易被核酸酶降解。為解決這一問(wèn)題,通過(guò)對(duì) pegRNA 的 3′端添加 RNA 結(jié)構(gòu)基序(G-quadruplex[25]、xrRNA[26]G-四鏈體[25]和 tevopreQ1(trimmed evopreQ1)[25]等)來(lái)增加 pegRNA 的穩(wěn)定性,進(jìn)一步提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率。添加 tevopreQ1 的epegRNA 與 MLH1dn 和 PEmax 協(xié)同作用可顯著提高編輯效率,其中 PE4max 和 epegRNAs 在 Hela 細(xì)胞和 HEK293 T 細(xì)胞中的編輯效率分別提高72 倍和3.5 倍;PE5max 和 epegRNAs 在 Hela 和 HEK293 T 細(xì)胞中的編輯效率分別提高12 倍和 1.6 倍。Zhang 等[18]在pegRNA的3′端添加病毒抗核糖核酸酶外基序(xrRNA)提高其對(duì)降解的抗性,發(fā)現(xiàn)xrPE在給定的細(xì)胞類型中堿基替換、小缺失和插入的編輯效率分別提高3.1、4.5和2.5倍。Liu等[19]將20 bp Csy4識(shí)別位點(diǎn)與經(jīng)典pegRNA的3′端融合,該位點(diǎn)自然存在于I-F型CRISPR/Cas9系統(tǒng)中形成發(fā)夾可抑制pegRNA 環(huán)化。Li 等[27]通過(guò)在pegRNA的逆轉(zhuǎn)錄模板的適當(dāng)位置引入同義突變來(lái)開發(fā)spegRNA,將PE的平均編輯效率提高353倍。通過(guò)改變pegRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)開發(fā)apegRNA,使PE的平均編輯效率提高2.77倍。當(dāng)spegRNA和apegRNA用于PE3和PE5系統(tǒng)時(shí),sPE3、aPE3、sPE5和aPE5系統(tǒng)的編輯效率都顯著提高。盡管在單個(gè)pegRNA中連接間隔區(qū)和模板序列可以確保它們?cè)谝龑?dǎo)編輯過(guò)程中的相近性,但分離這些成分也可進(jìn)行PE編輯。Liu 等[28]設(shè)計(jì)了一個(gè)分離的pegRNA系統(tǒng),該系統(tǒng)由靶向PE的正常sgRNA、含有PBS、RT模板的線性或環(huán)狀引物編輯模板RNA(petRNA)組成。petRNA還包含MS2發(fā)夾,通過(guò)結(jié)合融合的MS2外殼蛋白,促進(jìn)其募集到RT。Feng 等[29]建立了一種類似的編輯系統(tǒng)稱為Split pegRNA引導(dǎo)編輯(SnPE)。這兩項(xiàng)研究都表明,用單獨(dú)的sgRNA和模板RNA進(jìn)行PE編輯是可行的。另外,PBS 和 RT 模板的長(zhǎng)度與編輯效率沒(méi)有絕對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,通常需要設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的 PBS 和RT 模板進(jìn)行編輯嘗試,前期相關(guān)研究中建議 PBS 和RT 模板的起始長(zhǎng)度為 13 nt和 10～16 nt,但是當(dāng)編輯位點(diǎn)的 G/C 含量超出 40%～60%時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短 PBS 長(zhǎng)度,并且 RT 模板與 sgRNA 骨架 3′端連接的第一個(gè)堿基不能是 C[7]。Lin 等[30]發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在植物中 PBS 的Tm 值為 30 ℃時(shí)編輯效率最高,Tm 值過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響編輯效率,用雙 pegRNA 將編輯效率提高 1.8～4.2 倍,并且沒(méi)有產(chǎn)生額外的插入或缺失突變。

另外,通過(guò)piggyBac 載體[31-32]、腺病毒載體[33]遞送引導(dǎo)編輯系統(tǒng)或?qū)⒁龑?dǎo)編輯系統(tǒng)構(gòu)成一元載體[34]、 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)分離成多個(gè)載體進(jìn)行基因編輯[30]。引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中加入HPT 抗性基因構(gòu)建 pPE2、pPE3/3b,發(fā)現(xiàn)水稻中pPE2系統(tǒng)可以在不同的基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)編輯,在轉(zhuǎn)基因T0植物中pPE2產(chǎn)生的突變體發(fā)生頻率為0～31.3%,這表明pPE2的效率在不同的基因組位點(diǎn)和不同結(jié)構(gòu)下差異很大,并將HPT-ATG 回復(fù)突變加入到篩選過(guò)程中構(gòu)建 surrogate PE2 系統(tǒng),該系統(tǒng)能夠富集編輯細(xì)胞提高編輯效率[35-37]。Oh 等[38]利用 SpCas9 的同系物 FnCas9 構(gòu)建新的引導(dǎo)編輯系統(tǒng),SpCas9 是在 PAM 上游 3～4 bp 之間對(duì)非靶向鏈進(jìn)行切割,而 FnCas9 的切割位置在 PAM 上游 6～8 bp 之間,且FnCas9 和 SpCas9 識(shí)別同樣的 NGG PAM,因此 FnCas9 的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)具有更大的編輯窗口,擴(kuò)大PE 的編輯范圍。

3 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

目前針對(duì)全基因組的特異性分析發(fā)現(xiàn)不會(huì)產(chǎn)生顯著的單核苷酸水平脫靶及indels,由于逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的在引物序列之外的延伸,引導(dǎo)編輯可能會(huì)在目標(biāo)位點(diǎn)引入小的插入,但其脫靶率遠(yuǎn)低于 CRISPR/Cas9 和 BE 編輯系統(tǒng)[39]。Zong 等[40]測(cè)試engineered plant prime editor (ePPE)對(duì)pegRNA中錯(cuò)配的耐受性,包括在水稻原生質(zhì)體中的間隔區(qū)或引物結(jié)合位點(diǎn)和間隔區(qū)中的錯(cuò)配,ePPE在內(nèi)源性位點(diǎn)的脫靶效應(yīng)包括11個(gè)pegRNA的間隔區(qū)中的1～3個(gè)錯(cuò)配,共導(dǎo)致29個(gè)脫靶位點(diǎn)。深度測(cè)序顯示除了OsCDC48-T1(OT-22)外ePPE和PPE在所有檢測(cè)位點(diǎn)都表現(xiàn)出非常低的引導(dǎo)編輯脫靶效率,與PPE相比ePPE表現(xiàn)出更高的誘導(dǎo)編輯效率。Nelson等[41]測(cè)試每個(gè)靶向位點(diǎn)的前4個(gè)位置的indel產(chǎn)生和核苷酸變化,并比較PE3處理后epegRNAs和未修飾的pegRNAs之間的脫靶編輯,發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)位點(diǎn)epegRNAs和pegRNAs均表現(xiàn)出≤0.1%的引導(dǎo)編輯脫靶和indels產(chǎn)生,表明epegRNAs和pegRNAs表現(xiàn)出相似的脫靶編輯水平。Gao等[42]進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中引導(dǎo)編輯不會(huì)產(chǎn)生 gRNA 非依賴性 DNA 和 RNA 脫靶。Geurts等[43]利用全基因組測(cè)序檢測(cè)引導(dǎo)編輯修復(fù)類器官的脫靶效應(yīng),發(fā)現(xiàn)在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不同的編輯效率和突變,并強(qiáng)調(diào)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在建模致癌突變方面的廣泛適用性。Habib等[44]比較引導(dǎo)編輯和堿基編輯以糾正來(lái)自α1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏癥患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的疾病相關(guān)突變,發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域不會(huì)導(dǎo)致基因組中g(shù)RNA非依賴性脫靶突變。總之,引導(dǎo)編輯系統(tǒng)相比 CRIPSR/Cas9 和堿基編輯系統(tǒng)具有更高的特異性,也更加安全,但仍需進(jìn)一步降低其脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

4 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的應(yīng)用

由于引導(dǎo)編輯系統(tǒng)強(qiáng)大的編輯功能及普遍性,已迅速應(yīng)用在各物種及各個(gè)研究領(lǐng)域中,本文將概述其中的一些進(jìn)展(表2)。

表2 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的應(yīng)用Table 2 The applications of prime editing system

4.1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在動(dòng)物中的應(yīng)用

Park等[45]利用引導(dǎo)編輯系統(tǒng)完成編輯頻率高達(dá)47%的Igf2突變小鼠,并觀察到該性狀可在種系傳遞、無(wú)脫靶效應(yīng)。Gao等[46]比較HDR和PE2在小鼠中對(duì)CArG box轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的編輯作用,對(duì)創(chuàng)制小鼠的分析發(fā)現(xiàn)成功編輯HDR(20/37)的動(dòng)物數(shù)量大約是PE2(12/47)的兩倍,但HDR創(chuàng)制的小鼠存在不同位置上的indels產(chǎn)生。研究表明使用PE腺病毒修復(fù)苯丙酮尿癥小鼠模型中的Pah F263 S突變[47]。Qian等[48]利用引導(dǎo)編輯系統(tǒng)建立TSD兔模型,并對(duì)HEXA中的TATC兔模型中肌無(wú)力、共濟(jì)失調(diào)和精神障礙的典型表型進(jìn)行了表征,發(fā)現(xiàn)PE2和PE3編輯效率分別為4.1%～15.4%和8%～37.5%。Kim等[49]確定引導(dǎo)編輯在犬中的可行性并利用其生產(chǎn)犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良相關(guān)基因矯正犬。Liu等[50]通過(guò)顯微注射將PE3 mRNA和靶向Hoxd13(G/C和G/T)位點(diǎn)的pegRNA注射到小鼠胚胎中,編輯效率分別在27%和10.5%,indel效率在0%～0.3%。Petri等[51]在斑馬魚胚胎中使用純化核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)PE編輯技術(shù)引入所需的突變,編輯后發(fā)現(xiàn)精準(zhǔn)刪除和插入編輯效率分別為4.13%～33.61%和0.10%～18%并且形成較少的副產(chǎn)物。Bosch等[52]通過(guò)雜交在生殖細(xì)胞中表達(dá)gRNA和PE2蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅產(chǎn)生引導(dǎo)編輯的黑腹果蠅。Atsuta 等[53]通過(guò)PE與轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組整合、藥物篩選和單細(xì)胞培養(yǎng)方法相結(jié)合,產(chǎn)生引導(dǎo)編輯的雞成纖維細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞(PGCs)。Aida等[54]利用引導(dǎo)編輯技術(shù)在小鼠胚胎中引入10種靶向修飾包括替換、刪除和插入,表明在哺乳動(dòng)物受精卵中引導(dǎo)編輯具有高效性。

4.2 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用

在單子葉植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中,研究表明PEs可以精確編輯水稻原生質(zhì)體和小麥的基因組,其效率通常低于10%[38,55]。Hua等[56]在水稻中構(gòu)建包含CaMV 35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的非活性EGFP序列的Sp-PE2和Sp-PE3,通過(guò)后期篩選發(fā)現(xiàn)Sp-PE2和Sp-PE3水稻的編輯效率分別為15.6%和17.1%。Lin 等[57]通過(guò)密碼子、啟動(dòng)子和編輯條件優(yōu)化,使引導(dǎo)編輯系統(tǒng)能夠在水稻和小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行點(diǎn)突變、插入和缺失,獲得再生的引導(dǎo)編輯水稻植株編輯效率高達(dá)21.8%。Xu等[58]利用引導(dǎo)編輯系統(tǒng)對(duì)水稻植株中的OsACC1進(jìn)行突變,并在篩選鑒定出抗除草劑變異植株。引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在雙子葉植物中也表現(xiàn)出了活性,這些植物比單子葉植物更難轉(zhuǎn)化。Lu等[16]通過(guò)優(yōu)化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)二倍體番茄中0.025%～1.66%的基因編輯。Biswas等[59]在水稻、花生、鷹嘴豆和豇豆原生質(zhì)體中利用引導(dǎo)編輯系統(tǒng)編輯了一個(gè)突變的GFP,在水稻中,雙pegRNA的編輯效率是含單pegRNA的16倍。在用雙pegRNA轉(zhuǎn)化后,花生、鷹嘴豆和豇豆也獲得經(jīng)過(guò)編輯的突變GFP原生質(zhì)體,盡管編輯效率比水稻低得多從0.2%～0.5%不等。Jiang等[60]利用引導(dǎo)編輯系統(tǒng)編輯玉米發(fā)現(xiàn)在ZmALS1和ZmALS2中分別有53.2%(33/62)和6.5%(4/62)的轉(zhuǎn)基因系攜帶S621I和W542 L突變;在兩個(gè)ALS基因中分別有4.8%(3/62)和4.8%(4/62)的品系攜帶純合S621I突變和S621I/W542 L雙突變。

4.3 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在基因治療中的應(yīng)用

基因治療是基因編輯工具的一項(xiàng)重要應(yīng)用,使用基因編輯工具直接修復(fù)致病突變有望治愈人類遺疾病[61]。基因治療方法通常不能恢復(fù)自然條件下的基因調(diào)控,不能隨著時(shí)間的推移而一直表達(dá)且遞送大片段的基因,而治療遺傳疾病的理想方法是永久糾正基因組原位置的致病突變。引導(dǎo)編輯作為糾正人類基因組致病突變的治療工具具有明顯的優(yōu)勢(shì),原則上可以糾正高達(dá)89%的與人類疾病相關(guān)的已知遺傳變異。

在培養(yǎng)的細(xì)胞系中,引導(dǎo)編輯已被證明可以直接糾正HEXA中導(dǎo)致Tay-Sachs的4 bp插入,導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞病的HBB E6V突變及CDKL5缺乏障礙的單堿基缺失[17]。在人類類器官模型中,引導(dǎo)編輯能夠修復(fù)與DGAT1缺乏、威爾遜病和囊性纖維化相關(guān)的突變[46,62]。PEs可以通過(guò)精確刪除SMN中的內(nèi)含子剪接沉默來(lái)拯救脊髓性肌萎縮的人iPSC模型中全長(zhǎng)SMN的表達(dá)[63]。Chemello 等[64]利用引導(dǎo)編輯技術(shù)插入2 bp,在Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良的人iPSC模型中恢復(fù)DMD閱讀框。Geurts等[43]對(duì)囊性纖維化CFTR-F508del突變進(jìn)行了功能修復(fù),并將引導(dǎo)編輯與CRISPR/Cas9介導(dǎo)的CFTR-R785*突變的同源性定向修復(fù)和腺嘌呤堿基編輯進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯修復(fù)類器官的全基因組測(cè)序結(jié)果中未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)。Jang等[65]通過(guò)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射DNMT1和ATP78,發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯效率可達(dá)約1.8%的點(diǎn)突變。當(dāng)來(lái)自隱性營(yíng)養(yǎng)不良大皰性表皮松解癥(RDEB)患者的COL7A1突變成纖維細(xì)胞時(shí),利用引導(dǎo)編輯矯正成纖維細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠中獲得RDEB模型[66]。Li 等[67]開發(fā)的一種矢量化引導(dǎo)編輯系統(tǒng)可在體內(nèi)S鐮狀細(xì)胞病(SCD)小鼠模型(CD46/Townes小鼠)中直接修復(fù)造血干細(xì)胞(HSC)中的SCD突變,43%的HbS被HbA取代從而大大減輕SCD表型。

5 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)設(shè)計(jì)工具

與長(zhǎng)度只有20 nt的傳統(tǒng)gRNA的基因敲除和堿基編輯相比,PE存在更復(fù)雜的pegRNA結(jié)構(gòu)。雖然手工設(shè)計(jì)pegRNA是可行的,但也需要仔細(xì)考慮pegRNA的設(shè)計(jì)規(guī)則(包括原間隔子位置、有利的PBS和RT模板以及鏈方向)。然而,這使得過(guò)程復(fù)雜容易出錯(cuò)并且對(duì)大規(guī)模的設(shè)計(jì)存在限制。

目前已經(jīng)開發(fā)一些在線軟件,幫助設(shè)計(jì)合適的pegRNA和nick sgRNAs(ngRNA)(表3)。Hsu等[68]開發(fā)PrimeDesign用于 pegRNA 的設(shè)計(jì)(SpCas9)并利用此工具構(gòu)建全面和可搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)—PrimeVar,該數(shù)據(jù)庫(kù)包含超過(guò)68 500 種人類致病性遺傳變異的模擬和糾正的 pegRNA 和ngRNA組合。Chow 等[69]開發(fā)pegFinder進(jìn)行PE2和 PE3 pegRNA設(shè)計(jì)(支持SpCas9,SpCas9-NG,Cas9-SpRY),還給出不同長(zhǎng)度的PBS 序列和RT 模板供科研人員選擇。Anderson等[70]設(shè)計(jì)pegIT同時(shí)設(shè)計(jì)用于靶基因PCR擴(kuò)增的引物,并且在軟件中也報(bào)告pegRNA和ngRNA(SpCas9,SpCas9-NG,CjCas9,SaCas9,SaCas9-KKH)間隔區(qū)的潛在脫靶位點(diǎn)。Hwang等[71]向引導(dǎo)編輯系統(tǒng)應(yīng)用者提供兩個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)站 PE-Designer和 PE-Analyzer。PE-Analyzer是PE結(jié)果分析的專用工具接受高通量測(cè)序數(shù)據(jù),在表中總結(jié)突變相關(guān)信息并提供交互式圖表。PE-Designer主要是用JavaScript編寫可進(jìn)行 pegRNA(SpCas9,SpCas9-NG,SpCas9-VRER,SpCas9-VQR,Cas9-SpRY ) 的設(shè)計(jì),包括目標(biāo)序列潛在的靶位點(diǎn)、pegRNA 延伸序列及ngRNA的序列。Lin 等[30]基于PBS 序列設(shè)計(jì)和雙pegRNA (NGG-pegRNA 和 CCN-pegRNA)的策略開發(fā)了植物 pegRNA ,為使用者提供包括PAM 序列、spacer 的 GC 含量、 引導(dǎo)編輯窗口、PBS 長(zhǎng)度、推薦的 PBS的Tm 值和RT 模板同源臂長(zhǎng)度等一系列參數(shù)選擇。Standage-Beier等[72]開發(fā)PINE-CONE用于pegRNA的高通量設(shè)計(jì)。Siegner等[73]開發(fā)PnB Designer用于PE的pegRNA和BE(SpCas9)的gRNA的設(shè)計(jì)。Li等[74]開發(fā)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的程序Easy-Prime,用于PE的pegRNA(SpCas9)的設(shè)計(jì)提高編輯效率。

表3 pegRNA 設(shè)計(jì)軟件Table 3 Software for pegRNA designing

6 問(wèn)題與展望

PE技術(shù)的快速發(fā)展,極大地提高對(duì)真核細(xì)胞基因組進(jìn)行精確修飾的能力。與CBE和ABE產(chǎn)生的編輯效率分別為50%和40.87%～64.22%相比,引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率相對(duì)較低,目前研究均基于改造PE蛋白及pegRNA結(jié)構(gòu)[75-76]。與其他基因編輯技術(shù)相比,引導(dǎo)編輯技術(shù)具有多能性、產(chǎn)物純度和目標(biāo)序列的特異性,推動(dòng)了許多創(chuàng)新性研究,對(duì)于動(dòng)植物精準(zhǔn)育種和微突變引起的疾病治療等方面有很大的應(yīng)用潛力。

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)已在多個(gè)物種中進(jìn)行成功編輯,有廣泛的普適性,但仍存在的問(wèn)題限制了其在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化中的廣泛應(yīng)用。與Cas9相比PE可誘導(dǎo)較低的脫靶編輯,但當(dāng)使用ngRNA時(shí)雖然提升了編輯效率同時(shí)也造成了更多的indels。PE編輯通常很難在沒(méi)有重組酶的幫助下有效地插入或替換超過(guò)100 bp的DNA[77]。PE編輯器M-MLV RT部分中的RNase H結(jié)構(gòu)域可以與蛋白質(zhì)翻譯終止因子eRF相互作用,促進(jìn)終止密碼子的通讀,當(dāng)完整的PE2被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時(shí),可能會(huì)造成整體蛋白的翻譯效率降低[78]。此外,通過(guò)消除MMR提升PE4和PE5編輯效率,但額外添加的MLH1dn使其尺寸達(dá)到約8.7 kb,限制了AAV包裝和體內(nèi)傳遞[17]。目前,有許多pegRNA設(shè)計(jì)工具可用,但沒(méi)有一個(gè)提供排名評(píng)分來(lái)告知用戶哪些是強(qiáng)烈推薦的pegRNA。因此,需要建立一個(gè)更全面、更準(zhǔn)確的計(jì)算模型,以減少密集的pegRNA的構(gòu)建和篩選過(guò)程。總之,引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在動(dòng)植物基因功能研究和育種方面有非常廣闊的前景,并且該技術(shù)有可能成為一種新的基因治療形式,以安全、高靶向的方式插入治療基因替代突變或缺失的基因。