腸道菌群調控動物腸道黏膜免疫和炎癥的研究進展

劉思弟,馬 賁,鄭 言,邱云橋,姚澤龍,曹中贊,欒新紅

(沈陽農業大學動物科學與醫學學院,沈陽 110161)

炎癥性腸病(IBD)的發病機制目前仍不完全清楚,然而,在宿主-微生物相互作用的背景下,發生IBD的首要因素可能是遺傳和環境[1]。腸道菌群失衡會導致腸道微生物易位、腸屏障功能受損并促進黏膜免疫系統的超活化和促炎細胞因子的產生,共同促進動物IBD的發生[2-4]。腸道微生物組是一個復雜的微生物生態系統,其與宿主共同進化出互利關系。腸道微生物群通過膳食纖維發酵、病原體防御以及維生素和必需代謝物的生物合成來參與宿主的生命活動,并通過與宿主的相互作用,參與維持宿主免疫系統的成熟和功能,從而有助于宿主的內環境穩態[5]。腸道除了與營養物質的消化和吸收功能相關之外,還通過調節宿主免疫系統使腸道對共生微生物具有耐受性,并且對致病菌有持續的控制,防止微生物過度生長和侵入腸上皮屏障[6]。當這種微妙平衡受到破壞時,可能對宿主的健康狀況產生病理后果,例如微生物組成的改變引發的生態失調可導致機體發生慢性炎癥[7-8]。本文將討論IBD動物的微生物群和免疫系統之間的關系和相互作用,并探討IBD的發生機制,以及通過現有的微生物靶向療法(包括抗生素、益生菌、益生元、后生素和糞便微生物群移植)調控腸道微生物群來治療并恢復體內免疫平衡的研究進展。

1 IBD動物黏膜免疫功能紊亂與腸道菌群失調

微生物穩態失衡導致致病菌在腸道內定植和侵襲,增加宿主免疫應答的風險,導致IBD的發生[9]。研究表明,IBD是一種多微生物疾病,多種腸道微生物因子、異常免疫應答和腸黏膜屏障減弱都會導致宿主對共生微生物出現異常免疫反應[10]。上皮屏障在維持腸內穩態中起著關鍵作用,因為它位于腸腔微生物和宿主免疫系統之間,同時也是暴露于許多環境因素的第一個位點,這些環境因素可以作為疾病活動的觸發因素[11]。

有研究發現,腸上皮細胞(IEC)中的TNFα-TNFR2信號傳導途徑通過增加肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表達,從而破壞腸道緊密連接[12],表明促炎細胞因子可以進一步增強上皮層的“滲漏”。此外,炎癥可誘導“杯狀細胞耗竭”,使細胞因子IL-7分泌失調,從而導致慢性炎癥[13]。Th17細胞大量存在于小腸黏膜固有層中[14],它們保護宿主免受感染,但是其過度活化也會引起腸道自身免疫性炎癥[15]。腸道微生物群對Th17的影響非常強[16]。例如,分段絲狀細菌(segmented filamentous bacterium,SFB)可以誘導產生黏膜CD4+Th17細胞,從而產生白介素IL-17和IL-22[17]。Nizzoli等[18]研究發現,從克羅恩病(CD)和結腸炎的宿主中分離的IL-17分泌細胞的致病性直接依賴于干擾素-γ(IFN-γ)分泌,從IFN-γ-/-小鼠中分離的Th17細胞的致病活性降低證明了這一點。相反的是,蘇金單抗(一種用于治療皮膚病和風濕病的單克隆抗體,其通過阻斷IL-17途徑發揮作用)與約1%的宿主中的IBD發病相關[19-20]。這種相互矛盾的作用可能是由于IL-17似乎發揮了抗炎的保護作用,有助于抑制Th1應答并維持腸上皮細胞的上皮屏障和腸內穩態的完整性[21]。

共生微生物群(例如雙歧桿菌和乳桿菌)組成的改變也可以影響腸黏膜調節性T細胞(T regulatory cell,Treg)的生成,已知共生微生物群在IBD的發病機制中起關鍵作用[22],缺乏Treg的小鼠發生了自發性結腸炎的結果證明了這一點[23]。革蘭陽性共生細菌在維持Treg體內平衡中起主導作用[24],有試驗證實,用革蘭陽性孢子對無菌(GF)小鼠進行微生物重建,發現小鼠恢復了Treg群體水平[25]。研究證明,來自梭狀芽胞桿菌定殖的小鼠IEC的培養上清液可以顯著增強叉頭翼狀螺旋轉錄因子3(winged helix transcription 3,Foxp3)表達細胞的分化,表明梭狀芽胞桿菌激活IEC并在結腸內產生TGF-β和其他Treg誘導分子[24]。這些數據表明,腸道微生物群的組成可以通過作用于Treg誘導軸來影響結腸穩態[26]。有研究表明,雛雞攝入腸炎沙門菌(S.Enteritidis)后能夠在轉錄層面啟動以炎癥反應為主的先天免疫反應,并在攻毒后第3天加強對炎癥反應的控制,促進機體向耐受階段轉變,部分腸道共生菌在沙門菌入侵過程中增殖,通過促進苯丙素類等次生代謝產物的產生形成與宿主的共生關系以及對致病菌的抗性,從而有助于維護腸道穩態[27]。

固有淋巴樣細胞(innate lymphoid cells,ILC),特別是ILC的亞型——3型固有淋巴樣細胞(group 3 innate lymphoid cell,ILC3),對腸黏膜免疫具有雙向調節作用,其分泌的白介素IL-22、IL-17在維護機體腸道免疫系統中具有重要功能,而非正常激活ILC3致使IL-22過量分泌則會加重動物腸道炎癥[28]。ILC3也被認為在IBD的發病機制中發揮重要作用[29]。在克羅恩病(CD)宿主的腸道中,產生IL-17的ILC3細胞增加[29]。在動物IBD模型的腸黏膜中發現的IL-22+ILC3s缺乏引起腸黏膜屏障損傷,導致腸組織暴露于大量抗原[30]。通過ILC3產生IL-22是針對病原體(例如嚙齒檸檬酸桿菌)的保護性免疫,是機體所必需的,因為缺乏ILC3或IL-22的小鼠很快死于感染[31]。在IBD宿主的炎性發展期間,單核細胞移動到腸中分化成巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells,DC),并且后者表達更高水平的TLR2和TLR4,這可能有助于改變對共生體和CD40的免疫應答[32]。此外,中性粒細胞顯示出重要的抗菌功能,其依賴于中性粒細胞胞外陷阱(neutrophi L extracellular traps,NETs)的形成[33]。異常NET的產生和/或清除與幾種免疫疾病相關,包括潰瘍性結腸炎(UC)[34]。在UC中,TNFα刺激下過度NETs 形成可放大腸道中的致病信號[35]。已經有研究表明,白色念珠菌可能通過巨噬細胞中的樹突狀細胞相關C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)[36]和嗜中性粒細胞中的TLR4相關的途徑與黏膜先天免疫細胞相互作用,并通過誘導B淋巴細胞的增殖和分化,同時增加免疫球蛋白IgA分泌漿細胞數量[37]。有研究表明,從健康雞腸道成功篩選到1株益生特性優異的益生菌株L.reuteriS5,從乳酸菌調控肉雞腸道菌群和宿主基因表達抗病原菌感染的角度,證明了其抗S.enteritidisATCC13076腸道感染的調控作用[38]。

2 調控腸道微生物群治療腸道炎癥

流行病學調查表明,隨著經濟的持續增長,IBD的發病率正在迅速上升,眾多學者利用高通量測序的方法研究了IBD中相關遺傳易感性因素與腸道菌群之間的關系[39]。IBD被認為是宿主與微生物相互作用的結果,腸道菌群失衡可能促進炎癥過程的發生和/或惡化[40]。

IBD的常規治療主要是通過使用類固醇、硫嘌呤、生物藥物(即免疫抑制劑)來抑制增強的免疫應答。用于IBD治療的多種化合物能夠預測治療結果的變量或生物標志物,以找到給定治療的最佳候選藥物。最近的研究表明,IL-6的水平可以預測生物治療12個月時的臨床反應,從而有助于設計個性化治療策略[41]。這些生物藥物也可以通過恢復腸道微生物群的組成起作用,例如阿達木單抗能夠通過使C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)水平和腸道微生物群落結構正常化來控制炎癥[42]。這些免疫抑制療法并不總是有效的,并且有可能帶來嚴重的副作用。因此,需要開發個性化策略,來確定不同動物應當使用的特定藥物,再用該藥物進行治療[43]。基于對IBD發病機制現有的了解,旨在恢復IBD宿主腸道生態失調和免疫穩態的微生物靶向治療似乎是有希望的治療選擇。目前,已經探索了幾種療法,其中包括抗生素治療、益生菌和益生元的使用,以期靶向調節腸道微生物群組成[44]。

2.1 抗生素

由于目前已經認識到一些細菌種類可能在IBD宿主中起作用,因此,人們開始有選擇性地應用抗生素來控制腸道炎癥。如使用環丙沙星、甲硝唑或利福昔明來減少致病菌的豐度[45]。用米諾環素(一種半合成的第二代四環素)治療小鼠結腸炎,可減少促炎細胞因子產生[46]。利福昔明是一種不可吸收的抗生素,能減少結腸炎癥和腸系膜淋巴結(mesenteric lymph nodes,MLN)細菌移位,顯示出極好的安全性[47],然而,它的治療功效還沒有得到驗證[48]。盡管廣譜抗生素的使用有一些不錯的臨床效果,但其嚴重影響腸道微生物群的組成,阻礙腸道微生物群的重建[49]。有研究證明,廣譜抗生素短期治療會影響腸道恒定自然殺傷T細胞(invariant nature killer T cell,iNKT)的功能,但在腸道沒有炎癥的情況下,對CD4+T細胞的功能沒有影響[50]。抗生素治療后,腸道微生物群的重建足以將結腸iNKT和CD4+T細胞轉向Th1-Th17促炎表型,導致腸道炎癥發生時臨床狀況加重[50]。

2.2 益生菌

益生菌是活的微生物,能夠以非藥理學方法促進腸道健康,并可能調節IBD中的生態失調[51],其使用效果主要取決于它們的代謝和代謝副產物,這些產物能夠促進腸道環境中細胞組分的釋放,進而激活免疫應答,這種作用的機制在很大程度上是應變依賴性的[52]。口服益生菌治療炎癥性腸病,可以有效調節炎癥和腸道微生物群[53]。益生菌和樹突狀細胞之間的相互作用,可能影響隨后抗原特異性T細胞對Th1、Th2、Th17或Treg細胞的應答[54]。乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的不同菌株能夠顯著降低促炎因子IL-6和IL-17水平[55],通過抑制巨噬細胞和上皮細胞中的NF-κB信號通路恢復Treg/Th17平衡[56],并控制屬于腸桿菌科的致病菌的過度生長[57-58]。大腸桿菌Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917,EcN)鞭毛蛋白能夠誘導TLR5的強烈活化,并因此增強IL-22的產生,IL-22是介導上皮重建的細胞因子[59],其通過Treg擴增促進腸免疫穩態[60]。此外,益生菌可通過宿主的PPARγ信號通路間接影響致病菌定殖[61]。產丁酸菌與微生物失調引發的消化道炎癥等現象也相關,產丁酸菌能夠利用飼料中不易消化的碳水化合物合成丁酸,通過調控腸道菌群結構、為腸道上皮細胞供能、增強腸黏膜屏障功能等維護腸道健康,發揮對動物健康的有益作用[62]。

2.3 益生元與合生元

益生元是刺激益生菌生長和提高活性的不可消化的膳食化合物,能夠提升代謝這些底物的共生細菌競爭優勢,或通過增加由其發酵產生的有益代謝產物[4]。由于益生元對消化道酶的水解具有抗性,因此它們可以被結腸厭氧菌發酵,產生對宿主生理重要的代謝物,如短鏈脂肪酸(SCFA)[63-64]。據報道,高纖維飲食可防止實驗性腸道炎癥的發展[65],并直接與宿主細胞相互作用,調節免疫反應[66]。高劑量的果膠降低包括IL-1β和IL-6在內的結腸促炎介質的表達[67]。口服補充2-巖藻糖基乳糖顯著降低IL-10-/-小鼠結腸炎的嚴重程度,并降低IL-1β和IL-6的表達,增加TGF-β的表達和盲腸丙酸的濃度,同時增加共生瘤胃球菌的數量[68]。竹蓀多糖(DIP)被證明在BALB/c小鼠[69]和DSS誘導的結腸炎小鼠[70]中具有恢復抗生素誘導的腸道生態失調和炎癥反應的治療潛力。在實驗性DSS結腸炎中,圓葉葡萄或葡萄酒植物化學物質能夠降低結腸髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性以及IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[71]。在結腸炎動物中補充全麝香葡萄(FMG)或脫醇麝香葡萄酒(DMW)可降低梭菌屬和阿克曼氏菌屬的相對豐度,增加羅斯拜瑞氏菌屬、厭氧桿菌屬和糞球菌屬的豐度,導致糞便中丁酸、乙酸和IgA的水平升高,表明適應性免疫系統具有強大的激活能力[72]。益生元和益生菌的組合,稱為“合生元”,可以為宿主提供有益效果并提高其各成分的活力[73]。飼糧中添加益生菌和合生元可以降低妊娠-哺乳期母豬血漿促炎細胞因子含量,增強妊娠至哺乳階段母豬體液免疫功能,改善哺乳后期母豬抗氧化能力,有利于母豬的機體健康[74]。益生菌、益生元等物質可改善犬貓腸道菌群結構及相關代謝產物含量,滿足寵物不同階段的生理需求,優化伴侶動物的營養和健康狀況,為伴侶動物的健康與福利提供保障[75]。合生元對機體的效果優勢更明顯,但有關其具體配伍及使用還需大量的基礎研究支持[75]。

2.4 后生素

后生素也有稱為“益生素”,或代謝產物、生物源素(biogenics),是指由活菌代謝活動分泌(代謝產物)或細菌死亡溶解后釋放的可溶性因子,能夠對宿主產生有益影響。可溶性因子包括:SCFA、酶類、肽、磷壁酸、肽聚糖衍生物—胞壁肽、內源性和外源性多糖、細菌外膜蛋白、維生素、膽汁酸、縮醛磷脂以及長鏈脂肪酸等[76]。在大多數情況下,其來源于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬菌株,但也有來源于鏈球菌屬和糞桿菌屬物種[77]。共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid,CLNA)是從植物乳桿菌ZS2058發酵過程中產生的一種不飽和脂肪酸,也是一種潛在的后生素。CLNA的異構體CLNA-1和CLNA-2能顯著降低MPO和促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的水平,同時上調IL-10和核受體PPARγ的表達[78]。木聚糖丁酸酯(XylB)是釋放丁酸酯的多糖衍生物。XylB治療可以逆轉實驗性結腸炎中促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-17A)和抗炎細胞因子(IL-10)之間的失衡。此外,XylB重新平衡了腸道微生物群,并顯著降低了顫桿菌屬、瘤胃球菌科、丹毒梭菌屬和Defluviitaleaceae菌科的相對豐度[79]。

2.5 糞便微生物群移植

通過糞便微生物群移植(FMT)的腸道微生物群操作,也就是將健康供體的微生物群轉移到IBD宿主體內,以治療微生物生態失調[80-81]。目前,FMT已被證明在治療復發性和抗生素耐藥的艱難梭狀芽胞桿菌感染(CDI)方面效果不錯,治愈率接近90%[82]。然而,盡管在CDI中FMT有效地消除了病原體及其毒力因子,但對FMT在IBD中的治療作用背后的機制知之甚少[83]。在急性實驗性結腸炎期間施用治療性FMT,可以直接調節先天性和適應性黏膜免疫應答,以控制腸道炎癥,治療性FMT不僅能夠減少結腸炎癥,降低促炎細胞因子TNF、IL-1β和IFN-γ的水平,而且還能夠通過同時激活不同的免疫介導的途徑來啟動腸道穩態的恢復;事實上,與DSS處理的小鼠相比,FMT處理的小鼠結腸IL-10含量更高,產生IL-10的抗原提呈細胞(antigen-presenting cells,APC)、CD4+T細胞和iNKT細胞的頻率更高。FMT治療降低了DC、單核細胞和巨噬細胞向結腸T細胞呈遞主要組織相容性復合體(MHC-II)依賴性細菌抗原的能力[84]。此外,在慢性實驗性結腸炎背景下,治療性FMT給藥通過調節促炎基因的表達穩定地降低了結腸炎癥[84]。FMT的小鼠表現出表達細胞毒性相關分子CD107a的CD4+T和CD8+T細胞比例較低,以及表達結腸MHC-II的專職APC減少[84]。Tang等[85]研究表明,給仔豬服用FMT膠囊可使受體仔豬外周血中CD4+T細胞和CD4+/CD8+比值顯著升高,且FMT膠囊可提高仔豬結腸組織中IL-4和IL-10的含量,并降低TNF-α和IFN-γ的含量。一項基于小鼠模型觀察腸道菌群紊亂對牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)易感性的影響研究證實,FMT回補給菌群紊亂小鼠后,BVDV載量顯著降低,十二指腸病理變化也明顯改善,說明FMT回補具有抑制BVDV感染的作用[86]。還有研究證實,采用FMT對腹瀉羔羊進行治療能夠有效改善羔羊腹瀉癥狀,抑制腸道炎性反應,顯著降低羔羊腹瀉率[87]。更好地了解宿主對這些微生物的反應可能會有助于挖掘基于微生物組治療結果產生的潛在的預測標志物,并應在未來的FMT試驗中進一步探索[88]。

3 小結與展望

IBD是由遺傳易感宿主對腸道微生物群的免疫應答失調引起的。盡管IBD動物的臨床異質性以及其獨特的腸道微生物群特征可能降低當前治療的功效,但在未來根據個體的微生物群模式和免疫學特征選擇治療靶點及設計個性化的有效干預策略是可以嘗試的。迄今為止,IBD動物的基礎治療采用抗生素和免疫調節劑,由益生菌、益生元、后生素或糞便微生物移植作為更進一步的治療手段。基于個體宿主的臨床和微生態狀態的不同,應在當前臨床實踐中實施,以促進穩態免疫應答,從而以更有效、以宿主為導向的方式治療IBD動物。