牛呼吸道合胞體病毒G和F蛋白的生物學功能

郭雪蓮,李永琴,李瑞乾,李 昊,靳雙媛,王雪妍,杜家偉,許立華

(寧夏大學動物科技學院,銀川 750021)

牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是引起犢牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,可導致牛呼吸道合胞體病(bovine respiratory syncytial disease,BRSD),主要臨床癥狀為支氣管炎、細支氣管炎、肺炎、發燒,呼吸困難、呼吸頻率加快、流鼻液等[1-2]。BRSV具有發病率高、發病年齡小的特點,主要通過污染物、呼吸道飛沫或鼻腔分泌物進行傳播,臨床和亞臨床動物均能傳播[3]。由于全世界活體動物或動物產品的貿易往來,使得BRSV呈現世界性的分布,給養牛業造成極大的經濟損失。據統計,由于死亡損失、生產性能下降以及疫苗和治療費用,每年因BRSD和其它呼吸系統疾病給養牛業造成的經濟損失高達30億美元[4]。我國自從2007年首例BRSD病例確診后,BRSV在我國東北和西北等地區迅速廣泛傳播,得不到有效控制,嚴重制約了我國畜牧業的發展[5-7]。

BRSV屬于副黏病毒科(Pneumoviridae),正肺病毒屬(Orthopneumovirus),是一種具有囊膜的單股負鏈RNA病毒,病毒粒子主要呈球型和長絲狀。BRSV與人呼吸道合胞體病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)在所致疾病流行病學、臨床癥狀和病原分子結構特征有很多相似之處。因此,感染BRSV的犢牛是研究HRSV致病機制和疫苗開發的重要動物模型[8-10]。BRSV主要編碼11種蛋白,其中附著蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是唯一能夠在動物模型中誘導產生中和抗體和保護性免疫應答的蛋白,尤其是高度保守的F蛋白上的某些抗原表位和糖基化位點可以刺激機體產生高水平的中和抗體[11]。目前,和國內外對于HRSV囊膜表面糖蛋白G和F的結構功能及疫苗研究相比,有關BRSV-G和F蛋白的研究相對薄弱。因此,明確BRSV的基因組結構,特別是掌握具有免疫防制研究價值的G和F蛋白結構,將為研究新型有效的疫苗提供理論依據。本文旨在對BRSV的G和F蛋白最新研究成果進行論述, 以期對我國在BRSD疫苗研發及疫病防控方面的研究有所幫助。

1 呼吸道合胞體病毒分子生物學特征

BRSV是一種有囊膜、纖突、不分節段的多形態病毒,在電鏡下多呈現球型和長絲狀,基因組由15 222個核苷酸組成,包含10個基因,編碼9種結構蛋白和2種非結構蛋白,順序依次為3′-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5′[12-13]。BRSV包膜包含三個完整的跨膜包膜糖蛋白:附著蛋白(G)、融合蛋白(F)和疏水小蛋白(SH)。其中G蛋白負責病毒附著,與其他副黏病毒的附著蛋白沒有任何序列或結構同源性,缺乏血凝和神經氨酸酶活性,在病毒中和中起次要作用[14]。F蛋白是主要的病毒中和抗原,其功能是介導病毒和細胞或細胞和細胞膜融合[15-16]。SH蛋白是一個高度保守的小型表面蛋白,可以改變宿主細胞膜的通透性[17]。在動物模型中SH蛋白缺失會使病毒復制減弱,且它與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)途徑對細胞凋亡的抑制作用有關[18]。RSV的核衣殼組分分別是L蛋白、P蛋白和N蛋白,它們是指導RNA復制的必要和充分條件[19-20]。非糖基化基質(M)蛋白介導核衣殼和包膜之間相互作用[19]。轉錄延伸因子M2-1是由M2基因的兩個開放閱讀框(open reading frame,ORF)中的第一個翻譯而來[20]。M2-2蛋白是平衡RSV轉錄和復制的病毒調節因子,由M2基因中的第二個開放閱讀框翻譯而來[15]。NS1和NS2兩個非結構蛋白,在受感染的細胞中合成,它們合作介導逃避宿主細胞的干擾素反應和抑制細胞凋亡[13,20]。

2 G蛋白結構與功能

2.1 G蛋白的結構

BRSV-G蛋白是相對分子質量為90 ku,含257個氨基酸(aa)的Ⅱ型糖蛋白,可促進病毒附著在易感宿主細胞上[21-22]。它與其它副黏病毒科病毒之間沒有抗原交叉反應,是BRSV的主要保護性抗原之一,主要包含N端細胞質結構域、跨膜區和細胞外結構域。G蛋白主要有可溶性(Gs)和膜結合(Gm)兩種形式。Gs以單體形式存在,N末端被水解,缺乏信號/膜錨區,可從感染細胞中分泌出來,而Gm 可能是同源四聚體[23]。G蛋白的外域是一個模塊化的結構,由中央保守區和兩端的兩個高度糖基化的黏蛋白樣區域(即HVR1和HVR2)構成[24]。中央保守區合成肽C端的第171～186 aa部分是一個剛性結構。這個剛性結構由兩個反向平行的α-螺旋組成,通過Ⅰ′型轉折和兩個二硫橋連接Cys173～Cys186(外橋)和Cys176～Cys182(內橋)形成胱氨酸套索,進而形成一個圓盤狀結構,里面是一個具有受體結合位點的疏水性口袋[25-26]。

2.2 G蛋白在病毒感染中的作用

G蛋白具有高度變異性,主要參與受體結合、吸附和抗體產生過程[5],是BRSV和HRSV分型的主要依據。當G蛋白發生突變時,特別是174～188 aa之間的免疫顯性區域的突變,可能影響G蛋白的抗原性變化[27]。Leme等[27]通過對巴西的10個BRSV菌株進行研究比對,發現G蛋白中央保守區中第180、183和184位的半胱氨酸發生替換,第181位丙氨酸突變為蘇氨酸,這些變化可能影響蛋白的抗原表位、抗體反應性和結合力。Furze等[28]通過對比BRSV A和B亞群G蛋白抗原性差異,發現第184位的aa在抗體識別中可能很重要,第205位的堿基決定mAb70的識別能力。2018年,我國學者在黑龍江首次發現BRSV Ⅲ亞群毒株,經RT-PCR和測序發現,G蛋白中央保守區的第165、169、181和187位發生氨基酸取代,這些取代可能對抗體的反應性和結合力產生影響[5]。G蛋白的中央保守區與55 ku腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)的第四亞域具有序列和結構同源性,會干擾腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)抗病毒和引起細胞凋亡的作用,促進病毒感染宿主[29]。此外,Gorman等[30]通過截斷和替換丙氨酸,發現第154～170殘基可能是RSV與宿主細胞結合的重要因素。

圖1 G蛋白結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of G protein structure

ON1基因型和BA基因型毒株是目前HRSV流行的主要毒株,經序列對比發現,在G蛋白C末端三分之一處分別出現了72和60 nt的串聯重復,這些重復具有增強G蛋白功能的作用,能增強病毒的附著和適應度[17,31]。

2.3 G蛋白抗原表位的作用

G蛋白的保守區和高變區都有針對中和抗體的抗原表位,主要分為三類:(1)所有病毒分離株共享的保守表位;(2)來自同一抗原組的所有病毒中存在的群特異性表位;(3)僅存在于同一抗原組的某些株中的特異性或可變表位。前兩種類型的表位位于G蛋白的中央保守段,而毒株特異性表位幾乎只局限于可變的C端1/3處。研究發現在RSV A型和B型病毒G蛋白158～189aa間存在一個保守的CD4+T細胞表位,該表位會在RSV反復感染中增強[32]。Varga等[33]發現了一個I-Ed限制性CD4+T細胞表位,核心序列主要位于RSV-G蛋白185～193 aa,主要引起Th l和Th 2 CD 4+T細胞記憶性應答,這種應答可能導致疾病增強從而對宿主產生不利的影響。Langedijk等[34]在氨基酸水平上解析了BRSV-G蛋白中央保守區的九種抗體的表位,發現第 177、180 位的突變可能會對抗原表面產生局部影響,不會影響骨架的結構,而第 183、184 位的突變則可能會對結構產生重大影響,這表明在 RSV-G 的進化過程中,病毒通過這些突變逃避抗體的識別。

3 F蛋白結構與功能

3.1 F蛋白的結構

F蛋白為Ⅰ型糖蛋白,高度保守,能夠促進細胞膜融合,形成特征性合胞體。在電子顯微鏡下,全長的F蛋白呈現蓮花狀,該蓮花狀由錐形和棒棒糖狀兩種蛋白棒構成。F蛋白前體稱為F0,由574個aa組成,可以在內質網天冬酰胺上糖基化,形成同源三聚體。F0在Arg109和Arg136處裂解,釋放p27,產生F1、F2兩個片段。P27具有高度可變性,近幾年研究發現該區域可能是抗原的靶點[35]。F1和F2鏈通過二硫鍵保持共價連接。RSV F2亞基由七肽重復序列C(HRC)組成,是物種特異性病毒進入細胞的決定因素[36-37]。Lawlor等[38]發現HRSV-F蛋白的F2片段中第66位aa的改變會影響其融合活性。F1亞基包括融合肽(FP)、七肽重復序列A(HRA)、結構域Ⅰ、結構域Ⅱ、七肽重復序列B(HRB)、跨膜結構域(TM)和細胞質尾部(CT)。研究發現,F1鏈N端三分之一對蛋白酶有抵抗力[39]。HRA位于F1的20～63 aa殘基,HRB位于F1的353～377 aa殘基,它們在所有副黏病毒F糖蛋白中都是保守的[40-41]。F蛋白有三個疏水序列(SP、FP和TM),在病毒粒子中以預融合的亞穩態構象存在,在膜融合過程中重新折疊形成高度穩定的融合后構象[40]。預融合狀態下,FP包埋在F蛋白中,當F蛋白與相應靶細胞受體結合后構象改變,HRA形成長長的螺旋狀,使FP暴露并插入到靶細胞膜中,隨后,HRA和HRB重排,形成穩定的6螺旋束(6HB)[42-44]。

圖2 F蛋白結構示意圖Fig.2 Schematic diagram of F protein structure

3.2 F蛋白在病毒感染中的作用

F蛋白是RSV表面高度保守的包膜糖蛋白,具有不穩定的融合前構象和高度穩定的融合后構象兩種形態,可介導病毒與宿主細胞膜融合,而融合前F蛋白的單克隆抗體可以阻止融合后F蛋白形成,抑制病毒-細胞膜融合[43]。在感染的Vero細胞中F蛋白主要分布在病毒絲上,這可能與病毒的組裝有關,而參與組裝的是F蛋白的TM和CT兩個結構域[40,44-45]。Oomens等[46]和Meshram等[47]通過缺失HRSV-F蛋白的CT或用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白的CT替換F蛋白CT發現,F蛋白的CT結構域具有細胞定位和產生感染性病毒樣粒子(virus-like particles,VLPs)的作用,而且CT的缺失或替換會廢除F蛋白與Triton不溶性膜(脂質筏)的相互作用,這表明CT提供的功能獨立于F蛋白外域和TM。

近年來研究發現,在缺乏G和SH蛋白的情況下,病毒仍能感染目標細胞并使其融合成合胞體[42,48]。Oomens等[36]通過在Vbac細胞系中缺失SH、G或者SH、G和F包膜糖蛋白的ORF發現,含有F蛋白的病毒不僅可以從cDNA中恢復,并擴增到接近野生型病毒的效價水平,還可以感染Vero和Hep-2細胞,這表明F蛋白是HRSV在細胞中是否具有感染性的關鍵因素。

在HRSV感染宿主呼吸道期間,會誘導中性粒細胞胞外殺菌網絡(neutrophil extracellular traps,NETs)中彈性蛋白酶、蛋白酶、溶菌酶等的釋放,這些酶具有殺滅微生物的作用[49]。Lopes等[49]將純化的HRSV-F蛋白與不同的酶孵育后,發現彈性蛋白酶和蛋白酶3能夠切割F蛋白使其裂解,從而使病毒失活。

3.3 F蛋白的糖基化位點和抗原表位的作用

BRSV-F蛋白包含有5個保守的N-糖基化位點,分別是位于F2亞基的N27和N70、位于F1亞基N500、位于p27的N116和N126[48,50]。N-糖基化對病毒的細胞表面表達、融合性、抗原性和干擾抗病毒免疫反應等方面有重要影響。Zimmer等[48]通過突變HRSV Long株F蛋白N-糖基化位點中的天冬酰胺,發現N70聚糖的缺失導致融合活性增加40%,N27和N70缺失使融合活性降低50%,而N500、N27/N500和N70/N500的缺失會使融合活性明顯下降90%,這表明N500位的N-糖基化是有效合成合胞體的關鍵所在。Leemans等[50]通過融合海腎熒光素酶(Renillaluciferase,Rluc)證實了N500位的N-糖基化在RSV-F融合中是必需的。他們還發現,去除N116位N-糖基化序列可以獲得更高的抗體滴度,更有效地清除病毒,這可能是因為去糖基化影響了F蛋白三聚體化,使得F蛋白構象發生改變,暴露表位中和[50]。

到目前為止,在融合前F蛋白中已經確定了六個抗原位點(?和Ⅰ～Ⅴ),其中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ抗原位點同時存在于融合后F蛋白中[51]。Ⅲ和Ⅳ抗原位點是構成原聚體間空腔的主要區域,大約位于融合前三聚體的頂端和尾部的中間位置,Ⅳ抗原位點是形成6HB的關鍵位點,這兩個位點序列發生變化時,會影響它們在F蛋白中的作用以及F蛋白融合狀態的過渡[51]。?表位存在于融合前F蛋白中,在小鼠體內可以引起更高的中和活性[52]。

T細胞反應主要傾向于G和F蛋白的抗原表位,這對宿主肺部病毒的清除至關重要。Levely等[53]通過比較健康成人的淋巴細胞對RSV或包含有RSV-G和F蛋白的重組桿狀病毒的增殖反應,發現這兩種病毒引起的反應高度相似,這表明RSV的一種或兩種糖蛋白是刺激人類淋巴細胞增殖的主要原因;進一步研究發現,F1亞基第328～355個aa區域和F2亞基第51～66個aa區域可能是T細胞反應的免疫優勢位點。Lpez等[39]在HRSV-F蛋白氨基末端三分之一處發現了兩個在HRSV和BRSV中保守的中和表位47F和7C2,并表示47F表位的完整性受F1亞基第262和268位aa影響。RSV-F糖蛋白是人類記憶CD4+T細胞的主要靶結構。Van Bleek等[54]發現人CD4+T細胞靶向的免疫顯性抗原多肽分布在F蛋白的整個序列上,而在牛中,CD4+T細胞主要靶向F1部分,另外,他們發現牛F1部分第301～316殘基肽段中只有一個位置(305Ile→Leu)與人類不同,可以同時被人類CD4+T細胞和牛T細胞識別。Kaplan等[55]在BRSV-F蛋白上發現了一個在北美型和歐洲型菌株間保守的新的CD+T細胞表位,核心序列為INDMPINTND,氨基酸范圍為261～269,該表位僅由DRB3 *01:01等位基因表達,該發現有助于進一步了解牛和人感染RSV后的免疫反應以及促進疫苗的開發。

4 G和F蛋白在疫苗研究與開發中的應用

目前,為防控BRSV,歐洲國家批準使用滅活疫苗和減毒活疫苗。雖然這些疫苗接種后可以一定程度地降低動物發病率,減少經濟損失,但仍然存在免疫期短、免疫效果差的特點,有時還會介導疾病加重。這樣,新型疫苗就成為近幾年研究的熱點。BRSV-G和F蛋白都具有引起免疫反應的能力。G蛋白產生的中和抗體具有很好的拮抗BRSV的能力,F蛋白為BRSV中最為保守的糖蛋白也有其獨特優勢。因此,很多研究者們都以G和F蛋白為首選來制備新型疫苗。

4.1 重組載體疫苗

利用減毒活病毒為載體,將選定的基因序列插入載體傳遞給人類或者非人類宿主進行新的表達是疫苗研究與開發的方法之一。對于BRSV和HRSV來說,G和F蛋白是其僅有的兩種保護性抗原。早期有研究將合成的BRSV-G基因插入到牛皰疹病毒1(bovine herpesvirus-1,BHV-1)的gE啟動子后構建成重組體疫苗接種犢牛,發現與對照組相比,接種BHV-1/G疫苗的犢牛鼻咽分泌物和BRSV顯著減少,在BRSV攻毒7 d后,犢牛肺炎病變程度顯著降低[56]。有研究者通過在小鼠體內誘導HRSV-G蛋白重組痘苗病毒或純化的HRSV-G蛋白的多克隆抗體,發現該抗體能有效地中和HRSV[57]。仙臺病毒(Sendai virus,SeV)是一種載體病毒,可以在血液和呼吸道黏膜組織中誘導快速并持久的B細胞和T細胞反應。SeVRSV是一種以仙臺病毒為載體包含RSV-F全基因序列的鼻內重組疫苗,可以保護非人靈長類動物免受RSV感染,給具有母體抗體的棉鼠接種時,其滴度與2個月大的人類嬰兒相當,這說明SeVRSV疫苗的效力不受2個月嬰兒母體抗體的影響[58]。Zhan等[59]開發了一種缺乏TM和胞內區域的RSV-F蛋白的重組SeVRSV-Fs疫苗,該疫苗在棉花鼠體內可以引發RSV特異性結合、誘導中和抗體產生以及T細胞反應,使機體完全免受RSV的攻擊。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)也是載體病毒的一種。Grieves等[60]構建了一種以NDV為載體包含RSV-F蛋白的重組疫苗,該疫苗可以保護小鼠及棉鼠免受RSV感染,長期誘導中和抗體產生。Sacco等[11]以NDV為載體建立了一種密碼子優化疫苗rNDV-BRSV Fopt,鼻內接種于初乳缺失的犢牛后,肺部和上呼吸道病毒載量降低,肺部病變減少,這說明該疫苗對于初乳缺失犢牛是安全的。

4.2 亞單位疫苗

疫苗研究和開發的另一種方法是通過一些方式提取并篩選出具有免疫活性的病毒特殊蛋白質結構制成亞單位疫苗。安全的疫苗不僅要基于病毒蛋白結構設計增強中和活性,還要誘導Th1免疫應答,這樣不會使得感染組織病變加重(如氣道的嗜酸粒細胞增多)。據報道,預融合F蛋白能在小鼠、棉花大鼠和非人靈長類動物中誘導高水平中和抗體,而添加合適佐劑會使得免疫效果進一步增強[61]。CTA1-DD黏膜佐劑是一種由霍亂毒素的A1亞單位(CTA1)與葡萄球菌A蛋白D片段的二聚體(DD)連接而成的基因融合蛋白。Li等[62]用大腸桿菌BL21構建了由CTA1-DD黏膜佐劑和預融合F蛋白(RBF)組成的重組蛋白黏膜疫苗CTA1-DD-RBF,該疫苗可以誘導高水平的中和抗體,抑制小鼠肺部病毒的復制,鼻內注射接種后可誘導Th1免疫應答。Ren等[63]將預融合F蛋白(PrF)分別與黏膜佐劑CpG ODN和脂質體(Lipo)鼻內免疫小鼠,在兩次免疫后發現,PrF+CpG組的小鼠產生了高滴度的中和抗體和Th1免疫反應,其中第二次免疫后的中和抗體滴度約是PrF+Lipo組的6倍,PrF組的26倍,給小鼠注射致死性病毒劑量后,PrF+Lipo組的小鼠存活率約為67%,PrF+CpG組為100%,這說明PrF與CpG ODN佐劑的結合完全保護小鼠免受致命劑量HRSV的攻擊。疫苗接種途徑不同也會影響免疫效果。Li等[64]通過鼻內和肌內不同途徑兩次接種添加了CpG佐劑的F蛋白,發現只有兩次都是鼻內接種的小鼠中和抗體滴度最高,支氣管肺泡灌洗液中的IgA抗體含量最多,還誘導了Th1免疫應答,并顯著減輕了肺部病理損傷,這表明鼻內免疫要優于肌內注射免疫。有些疫苗不僅不會保護宿主免受病毒感染,反而會引起疾病加強。Li等[65]用BL21表達的預融合F蛋白與商業明礬佐劑(GMP級Adju-Phos)一起免疫小鼠后不僅沒產生保護作用,反而造成了嚴重的Th2體液免疫反應以及肺部病變。因此,平衡的免疫反應是保證RSV疫苗安全性和有效性的關鍵。

4.3 納米疫苗

納米疫苗也是研究和開發疫苗的一個新方向。共價結合、吸附(在納米顆粒表面)以及包封(包裹在納米顆粒內部)是納米顆粒呈遞抗原的三種方式。納米顆?？梢詴簳r儲存抗原,具有保護蛋白防止被蛋白酶降解和使包被蛋白持續釋放的作用。納米顆粒大小一般為1～1 000 nm,大小接近天然病毒,具有免疫原性高(無需佐劑)、能輕易穿透毛細血管和黏膜細胞表面的特點,因此是作為黏膜免疫的首選疫苗。有研究將BRSV的融合后F蛋白和G蛋白包封在聚酸酐納米顆粒中,在單次鼻內注射后,引起犢牛呼吸道局部細胞和體液免疫反應,降低肺部病變和病毒脫落[66]。Madhi等[67]對RSV-F蛋白納米顆粒疫苗進行3期臨床試驗評價,結果表明該疫苗是安全的,具有免疫原性,可以預防嬰兒RSV下呼吸道感染。

5 展 望

BRSV是牛群呼吸道疾病暴發中最常見的病原體之一,目前主要分為Ⅰ～Ⅹ亞群[7,27,68-69],而我國主要流行的毒株是Ⅲ亞群毒株[68]。國內外的流行病學表明,BRSV分布廣泛,已經嚴重危害養牛業的發展,造成嚴重經濟損失[7,70-71]。而目前尚無有效的防控措施,這可能與BRSV復雜的致病機制有關。安全有效的疫苗是防控BRSV的關鍵手段,但滅活疫苗和減毒活疫苗在BRSV上存在尚未解決的問題,這種情況下重組載體疫苗、亞單位疫苗、納米疫苗等新型疫苗成為目前BRSV疫苗研究的熱點,目標抗原是RSV表面的G和F蛋白。G和F蛋白作為BRSV重要的結構蛋白之一,其結構和功能在BRSV病毒的感染性、復制和免疫應答中具有重要作用。但是對于G和F蛋白結構和功能的解析仍然有許多未解之處:比如目前研究發現HIV中SP信號肽會影響相鄰gp120蛋白的聚糖譜,從而影響gp120的免疫原性,而RSV的SP信號肽是否有相似作用尚未有報道[35]。P27是抗原靶點的預測尚未得到證實。BRSV G蛋白和F蛋白糖基化及其免疫原性的關系有待深入研究。對于這些問題的進一步解決可以幫助人們更加深入地了解BRSV,為BRSV的防控提供幫助。

BRSV具有活躍的變異性,而目前,在國內針對BRSV的分子流行病學的研究相對薄弱。因此,需要進一步追蹤BRSV的流行特點和分子特征,了解有關氨基酸變化、抗原表位和糖基化位點的數據,這將有助于確定BRSV-G和F蛋白的抗原性以及疫苗的開發。