綿羊 MYL 基因家族的鑒定與組織表達分析

楊 楊,余 乾,劉昱成 ,楊 華,趙 卓,王立民 ,周 平,楊慶勇,2* ,代 蓉*

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院,省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室,石河子 832000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院,武漢 430070)

新疆是傳統(tǒng)養(yǎng)殖大省也是牛羊肉消費大省。統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示,2022年底新疆羊肉產(chǎn)量60.72萬噸占全國的11.58%,羊胴體重平均16 kg以上,高出全國平均水平,但與美國、澳大利亞等畜牧業(yè)發(fā)達國家還存在較大差距。影響羊肉用性能的因素很多[1],其中品種是肉用性能提升的基礎(chǔ),而攜帶優(yōu)良肉用性能基因是產(chǎn)肉能力提升的核心[2]。

骨骼肌的生長發(fā)育與綿羊產(chǎn)肉性能密切相關(guān),肌纖維直徑的大小和肌內(nèi)脂肪含量多少是評價肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]。肌球蛋白是肌原纖維的組成單位,由兩條重鏈和四條輕鏈組成。肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MYL)是由基礎(chǔ)性輕鏈(essential light chain,ELC)和調(diào)節(jié)性輕鏈(regulatory light chain,RLC)組成的多基因家族[4],在維持重鏈構(gòu)象、調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育和肌纖維活性中發(fā)揮作用[5-6]。人基因組中已鑒定出 13 個MYL基因,其中MYL1、MYL3、MYL4、MYL6和MYL6B 是 ELC 型,其他屬于 RLC 型[7]。有研究發(fā)現(xiàn),MYL家族成員對羊肌細胞的生長發(fā)育也有調(diào)節(jié)作用[8-10]。Zhan等[11]分析了增殖和分化階段的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞表達譜,發(fā)現(xiàn)MYL2 基因參與調(diào)控山羊骨骼肌生成。MYL2 基因不僅參與產(chǎn)前肌肉纖維的產(chǎn)生,還涉及與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號通路[12]。Xie 等[13]分析了內(nèi)蒙古絨山羊不同部位的肌肉組織蛋白譜,鑒定出MYL3 基因在股二頭肌中顯著高水平表達,推測其表達水平與肌肉韌性有關(guān)。Noce 等[14]利用表達譜芯片分析了西班牙5個品種的肉用綿羊骨骼肌轉(zhuǎn)錄組,確定MYLPF在調(diào)節(jié)肌肉收縮上發(fā)揮重要作用。

綜上所述,MYLs在肌肉發(fā)生發(fā)育和功能形成方面有重要作用,但該基因家族在綿羊基因組中的成員及特性等缺乏系統(tǒng)全面的了解。因此,本研究利用生物信息學(xué)方法在綿羊基因組水平篩選MYL基因家族成員,并分析其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、選擇壓力和蛋白互作,比較MYLs在綿羊與山羊和牛基因組上的進化關(guān)系,確定MYLs在不同品種綿羊中的組織表達模式,為深入探討綿羊MYLs基因調(diào)控肌肉生長發(fā)育的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗羊均來自石河子市新疆農(nóng)墾科學(xué)院華宇基地種羊場。隨機選取飼養(yǎng)環(huán)境一致的軍墾白肉羊(n=3)、新疆細毛羊(n=3)和湖羊(n=3)成年公羊,屠宰后立即取骨骼肌(腿)、大腸、小腸、背最長肌、心、肝、瘤胃、脾、肺、腎等組織樣品,放入-80 ℃液氮中保存,以備提取 RNA。

1.2 主要試劑

動物組織總 RNA 提取試劑盒(DP431)、凝膠回收試劑盒(DP219)和SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強版(SYBR Green、FP205)都購自天根生化科技(北京)有限公司,pMD19-T 載體、cDNA 第一鏈合成試劑盒(RR047A)購自 TaKaRa 公司,大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞、T4 DNA 連接酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)來源

研究中的參考基因組數(shù)據(jù)及相關(guān)基因的編碼序列和氨基酸序列均從公共數(shù)據(jù)庫中獲得。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載綿羊參考基因組(GCA_016 772 045.1),從 Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)獲得綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、豬(Susscrofa)和牛(Bostaurus)MYLs 的氨基酸序列。基于省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室楊慶勇團隊構(gòu)建的多物種全組織表達譜數(shù)據(jù)庫 HTIR(http://yanglab.hzau.edu.cn/HTIR#/)獲取成年湖羊腦、心、肝、脾、肺、結(jié)腸、骨骼肌等 17 個組織的表達量數(shù)據(jù)。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù) NCBI 公布的綿羊MYL1、MYL6B 和MYLPF的 CDS 序列,利用 PrimerPremier 5.0 軟件設(shè)計基因克隆引物和熒光定量 PCR 引物(表1)。引物由賽默飛世爾科技公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4.2 RNA 提取和 cDNA合成 根據(jù) RNA 提取試劑盒提取各組織樣的總 RNA。取 1 μL提取的總 RNA 用核酸蛋白檢測儀測定 RNA 的質(zhì)量濃度,取 5 μL用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。檢測合格的 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3MYL1、MYL6B 和MYLPF基因克隆與測序 以軍墾白肉羊背最長肌 cDNA 為模板,擴增 3 個目的基因完整的 CDS 區(qū),擴增體系(15 μL):模板 cDNA 1.0 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,2×taq PCR MasterMix Ⅱ 7.5 μL,ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性8 min;95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共 35 個循環(huán);72 ℃延伸 10 min;4 ℃ 保存。產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用膠回收試劑盒回收目的片段,隨后將目的片段和載體 pMD19-T 連接、進行轉(zhuǎn)化及鑒定,挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.4 qRT-PCR 按照試劑盒推薦方法,qRT-PCR 采用 20 μL 反應(yīng)體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物各 0.6 μL,補足 RNase-free ddH2O 至終體積20 μL。PCR 程序:95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共 40 個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后通過熔解曲線檢測引物的特異性。以GAPDH作為內(nèi)參基因,每個樣品3次重復(fù),采用 2-ΔΔct法計算基因相對表達量,使用 GraphPad Prism 8 軟件分析作圖。

1.5 MYL 基因家族的生物信息學(xué)分析

1.5.1 綿羊MYL基因的鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析 利用在線數(shù)據(jù)庫 Pfam 檢索綿羊 MYLs 蛋白保守結(jié)構(gòu)域。以綿羊 MYLs 蛋白序列作為查詢序列,在綿羊蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行 Blastp 比對,通過 NCBI 的 CD-search 在線工具進行驗證,并利用綿羊參考基因組的MYL基因信息進行注釋校正[15]。使用 TBtools(v1.09)軟件[16]的 Gene Location Visualize(Advanced)繪制染色體定位圖。通過在線軟件 ExPASy 分析綿羊 MYLs 的氨基酸數(shù)目、等電點、分子量和親疏水性均值等信息。采用 WOLF PSORT 在線工具研究蛋白亞細胞定位。利用 SignalP 和 TMHMM sever 2.0 在線平臺預(yù)測MYLs基因家族蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域等[17]。

1.5.2 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析 利用 MEME 在線平臺預(yù)測 MYLs 的蛋白保守基序(Motif),基序數(shù)量參數(shù)為 10,其他參數(shù)默認。采用 TBtools 軟件對綿羊MYLs的進化關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)和 Motif 進行可視化分析。

1.5.3 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 利用 MEGA7.0 軟件內(nèi)置的 Clustal W 程序?qū)d羊、山羊、人、鼠、豬和牛的 MYL 蛋白質(zhì)序列進行序列比對,分析結(jié)果用 Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[18],選用泊松模型,校驗參數(shù) bootstrap 設(shè)置為1 000次重復(fù),其他參數(shù)默認[19]。利用在線工具 iTOL(https://itol.embl.de)渲染系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.4 共線性分析 在 TBtools 軟件的 MCScanX 功能界面分析綿羊MYL基因的復(fù)制事件,并分析綿羊和山羊(GCA_001 704 415.1)牛(GCA_002 263 795.3)之間的同源性,隨后利用 Advanced Circos 和 Dual Systeny Plot 進行可視化。提取綿羊、山羊和牛的MYLs基因 CDS 序列,通過 Simple Ka/Ks Calculator(NG)計算其非同義(Ka)和同義(Ks)替換。

1.5.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用 SOPMA 在線軟件預(yù)測綿羊 MYLs 的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。使用 STRING(https://string-db.org/cgi/input?sessionId)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),蛋白質(zhì)來源設(shè)置為綿羊(Ovisaries),其他參數(shù)默認,分析綿羊 MYL 與其他蛋白質(zhì)及家族成員間的相互作用。

1.5.6 羊MYL家族基因表達模式分析 在本實驗室構(gòu)建的 HTIR 數(shù)據(jù)庫中下載湖羊全組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從基因表達量數(shù)據(jù)(TPM)文檔中提取各組織MYLs 表達數(shù)據(jù),利用 TBtools 軟件的 Heatmap界面繪制湖羊MYLs在 17 個組織的表達量熱圖[20]。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊 MYLs 的鑒定及其在染色體上的分布

基于蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化關(guān)系,在綿羊基因組中鑒定到 12 個MYLs家族成員。根據(jù)基因注釋文件命名為MYL1、MYL2、MYL3、MYL4、MYL6、MYL6B、MYL7、MYL9、MYL10、MYLPF、MYL12A 和MYL12B。12個MYLs基因分布在9條染色體上(圖1),其中MYL6 和MYL6B 位于 3 號染色體,MYL3 和MYL12A 位于 19 號染色體,MYL10 和MYLPF位于 24 號染色體,剩余6個成員分布在 2、4、11、13、17 和 23 號染色體。

圖1 綿羊 MYLs 在染色體上的分布Fig.1 The chromosomes distribution of the MYLs in sheep

ExPASy 對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析的結(jié)果顯示,綿羊MYLs基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量在147個(MYL10)～211個(MYL6B)之間,相對分子質(zhì)量在 16 695.86(MYL7)～23 388.92(MYL6B)之間,等電點范圍為 4.37(MYL7)～5.40(MYL6B),脂肪指數(shù)為 52.27(MYL9)～82.18(MYL6B),不穩(wěn)定系數(shù)在 24.73(MYL10)～56.48(MYL4)范圍內(nèi)(表2),無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。親疏水性指數(shù)結(jié)果顯示,12 個成員均為親水性蛋白。MYL6B 和 MYLPF 蛋白亞細胞定位在線粒體,其他成員均在細胞質(zhì)中。

表2 綿羊 MYL 基因家族的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of MYL gene family in sheep

2.2 綿羊 MYLs 基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

參考人MYLs的劃分類型[5],結(jié)合系統(tǒng)進化樹結(jié)果(圖2),以基因結(jié)構(gòu)為參考將綿羊MYL家族成員分成 3 組,其中MYL2、MYL7、MYL10 和MYLPF在組 Ⅰ,MYL9、MYL12A 和MYL12B 在組 Ⅱ,組 Ⅰ 和組 Ⅱ 同屬于 RLC 型;組 Ⅲ 包括MYL1、MYL3、MYL4、MYL6 和MYL6B 是 ELC 型。EF-hand 結(jié)構(gòu)域(PF13405)是MYLs家族成員共有的保守結(jié)構(gòu)域。MYLs的外顯子數(shù)目在 1～8個之間,其中MYL1 和MYL7 包含 8 個外顯子,有 6 個外顯子的基因最多,占 50%。

圖2 綿羊 MYL 基因家族結(jié)構(gòu)與進化Fig.2 Gene structure and evolution of MYL gene family in sheep

同一組基因的 Motif 種類、數(shù)量和位置較為一致,每個基因包含 3～6個 Motif(圖3),Motif1 和 Motif2 是家族成員共有,RLC 型均有 Motif3,Motif4 和 Motif5 只在 ELC 型中出現(xiàn)。利用 Pfam 在線數(shù)據(jù)庫進行注釋,發(fā)現(xiàn) Motif1 包含 EF-hand 結(jié)構(gòu)域,這是MYL基因家族成員共有的保守結(jié)構(gòu)域[5]。

圖3 綿羊 MYL 基因家族保守基序Fig.3 Conserved motifs of MYL gene family in sheep

2.3 綿羊 MYL 基因家族系統(tǒng)進化分析

利用 MEGA7.0 比對分析了人(13個)、鼠(13個)、牛(13個)、豬(12個)、山羊(12個)和綿羊(12個)6種哺乳動物的 MYL 蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。結(jié)果顯示,與蛋白和基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。綿羊 RLC 型的 MYLs 進化關(guān)系與山羊較近,ELC 型與山羊和牛親緣關(guān)系較近。

圖4 人、鼠、豬、牛、山羊和綿羊 MYL 基因家族發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of MYL gene family in Homo sapiens(Hom.), Mus muscμlus(Mus.), Sus scrofa(Sus.), Bovidae(Bos.), Capra hircus(Cap.) and Ovis aries(Ova.)

2.4 綿羊 MYL 基因重復(fù)事件和共線性分析

根據(jù)綿羊基因組注釋文件,對MYLs進行物種內(nèi)和物種間共線性分析。12個MYLs中有 2 對基因,MYL2 和MYL10、MYL2 和MYLPF,存在片段復(fù)制現(xiàn)象(圖5),選擇壓力 Ka/Ks 值分別是 0.08 和 0.11,表明在進化過程中受到的純化選擇較強。物種間共線性分析結(jié)果顯示,綿羊(12個MYLs)、山羊(12個MYLs)和牛(13個MYLs)MYL基因家族高度保守。綿羊與山羊、綿羊與牛基因組之間分別存在 12 對(圖6a)和 14 對(圖6b)共線性關(guān)系。同時也發(fā)現(xiàn)一個基因同時和多個基因呈現(xiàn)共線性關(guān)系,其中綿羊MYL2 基因與牛MYL2、MYL10 和MYLPF同源。

灰色線表示綿羊基因組中的所有共線性區(qū)塊,而黃色線表示發(fā)生復(fù)制的 MYL 基因?qū)he gray line represents all the collinearity blocks in the sheep genome, while the yellow line represents the MYL gene pairs in which replication occurs圖5 綿羊 MYL 基因家族成員共線性分析Fig.5 Collinear distribution of MYL family members

綿羊與山羊(a)和牛(b)MYL 基因的共線性分析,背景中的灰色線表示綿羊與山羊、牛基因組中的共線性區(qū)塊,而紅色和紫色的連接線則突出顯示了 MYL 相關(guān)的共線性基因?qū)ynteny analysis of MYL genes between sheep and goat(a), sheep and cattle(b). The gray lines in the background indicate the collinear blocks within sheep and other animal genomes, while the red and purple lines highlight the syntenic MYL gene pairs圖6 綿羊與山羊和牛 MYL 的同源性分析Fig.6 Synteny analysis of MYL family members between sheep and goat, cattle

2.5 MYL 基因家族蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

綿羊 MYLs 氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)由 α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈組成(表3)。家族成員與肌球蛋白重鏈10(myosin heavy chain 10,MYH10)、骨骼肌肌動蛋白 A1(actin alpha 1,ACTA1)和肌動蛋白 γ1(actin gamma 1,ACTG1)等 33 個蛋白質(zhì)互作,其中 MYH10 與各成員都有互作關(guān)系(圖7)。

圖7 綿羊 MYLs 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Proteins interaction network of MYLs in sheep

表3 綿羊 MYL蛋白的二級結(jié)構(gòu)Table 3 Secondary structure of MYL protein in sheep

2.6 綿羊 MYL 基因家族組織表達分析

基于本實驗室搭建的多物種全組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中基因表達量數(shù)據(jù)(TPM),建立湖羊MYLs的組織表達模式(圖8)。結(jié)果顯示MYL1、MYL2 和MYLPF在長斜方肌、胸肌、腹外直肌、三角肌、腹外斜肌和背闊肌等骨骼肌中的表達水平顯著高于其他組織。MYL3 在骨骼肌組織中表達水平相對較高。MYL4 和MYL7 特異在心臟組織中極顯著地高表達。MYL6、MYL6B、MYL9 和MYL12B 在各組織中都有表達,其中MYL6、MYL9 和MYL12B 在非骨骼肌組織中的表達水平要高于各骨骼肌組織。MYL10 和MYL12A 在各組織的表達水平較低,或不表達。

數(shù)字代表表達量的值;顏色刻度條代表基因表達量The number represents the value of expression. The color scale bar represents the amount of expression圖8 綿羊 MYLs 基因組織表達模式Fig.8 Tissues expression pattern of MYLs gene family in sheep

2.7 MYL1、MYL6B 和 MYLPF 基因 CDS 克隆

PCR 擴增結(jié)果顯示(圖9),擴增產(chǎn)物條帶明亮且清晰,大小在 400～600 bp之間,與MYL1、MYL6B 和MYLPF基因 CDS 的全長(579、635和 450 bp)相比大小一致。測序結(jié)果表明,擴增片段為目的基因序列。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3.MYL1、MYL6B 和 MYLPF 基因;4.空白對照M.DNA Marker; 1-3. MYL1, MYL6B and MYLPF genes of sheep; 4. Blank control圖9 MYL1、MYL6B 和 MYLPF 基因全長 cDNA 擴增結(jié)果Fig.9 Full length cDNA amplification of MYL1, MYL6B and MYLPF

2.8 MYL1、MYL6B 和 MYLPF基因表達分析

以軍墾白肉羊為對象,運用 qRT-PCR 技術(shù)分析MYL1、MYL6B 和MYLPF基因在心、肝、肺和腎等10個組織的表達情況(圖10)。結(jié)果顯示,MYL1、MYL6B 和MYLPF基因在軍墾白肉羊背最長肌和骨骼肌中表達量極顯著高于其他組織(P<0.000 1)。MYL1 和MYLPF均在瘤胃、脾和肺低水平表達。MYL6B 基因在瘤胃和脾臟中的表達量高于在小腸、大腸、肝臟、肺部和腎臟中的表達水平。

以心臟組織的表達水平作為對照,****代表差異極顯著(P<0.000 1)The heart tissues was used as a control, **** represents an extremely significant difference (P<0.000 1)圖10 MYL1、MYL6B 和 MYLPF 在綿羊 10 個組織的表達Fig.10 Expression of MYL1, MYL6B and MYLPF in 10 tissues of sheep

比較了軍墾白肉羊、湖羊和細毛羊的心臟、肝臟和骨骼肌3種組織中MYL1、MYL6B 和MYLPF基因的表達差異(圖11)。結(jié)果顯示,MYL1、MYL6B 和MYLPF均表現(xiàn)出骨骼肌中高水平的特異表達。在這3個品種之間,MYL1、MYL6B 和MYLPF的骨骼肌表達差異非常顯著(P<0.000 1),且在軍墾白肉羊中的表達顯著高于湖羊和細毛羊。在不同品種的綿羊肝臟組織中,MYL1 的表達在細毛羊中極其顯著高于湖羊和軍墾白肉羊(P<0.000 1),而MYL6B 在湖羊中的表達水平則極顯著高于細毛羊和軍墾白肉羊(P<0.000 1)。

以心臟表達水平作為對照。圖柱上標(biāo)字母表示不同品種綿羊同一組織中基因表達量差異極顯著(P<0.000 1)。相同的大寫字母表示基因在骨骼肌組織中表達量差異極顯著,相同的小寫字母表示基因在肝臟組織中表達量差異極顯著Heart expression levels were used as a control. The letters on the bars in the figure indicate extremely significant expression differences of the same gene in the same tissue of different sheep breeds (P<0.000 1). The same capital letter indicates extremely significant expression differences of the gene in the skeletal muscle tissue, while the same lowercase letter indicates extremely significant expression differences of the gene in the liver tissue圖11 MYL1、MYL6B 和 MYLPF 基因在不同綿羊品種和不同組織中的表達量Fig.11 Expression of MYL1, MYL6B and MYLPF in different breeds and tissues of sheep

3 討 論

MYLs在人[7]、雞[21]和豬[22]肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明,該基因家族成員與羊肉用性能密切相關(guān)[13,23],但對綿羊中MYL家族成員缺乏全面系統(tǒng)的認識。本研究在綿羊基因組中共鑒定出12個MYL基因,它們共有 Motif1和 Motif2,其中 Motif1 包含 EF-hand 保守結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是鈣傳感器,Ca2+是骨骼肌興奮收縮耦聯(lián)的橋梁,當(dāng) EF-hand 與 Ca2+結(jié)合時發(fā)生構(gòu)象改變,完成與下游靶點的相互作用[24]。含有 EF-hand 結(jié)構(gòu)域的蛋白功能多樣[25],如細胞質(zhì)中的鈣緩沖,細胞區(qū)室之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉收縮等。

MYH10 是調(diào)控肌纖維組成和肌內(nèi)脂肪含量的候選基因[26-27]。岳彩娟等[28]分析了湖羊與灘羊的差異甲基化基因,發(fā)現(xiàn)MYH10 富集在與肌肉相關(guān)的功能調(diào)控通路中,與肌肉發(fā)育分化,肌纖維組成等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn) MYH10 是綿羊MYL基因家族共有的互作蛋白。由此推測,MYH10 與綿羊 MYLs 之間的蛋白互作,可能是調(diào)節(jié)綿羊骨骼肌收縮和發(fā)育的重要因素,但是具體調(diào)控方式有待進一步研究。

位于同一系統(tǒng)發(fā)育進化分枝上的蛋白可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[29]。本研究中, MYL1、MYL3、MYL4、MYL6 和 MYL6B 位于同一組,屬于 ELC 型。ELC 型肌球蛋白主要參與調(diào)節(jié)肌肉的受力和力學(xué)性能,它的變化可以影響肌肉纖維的收縮速度和力量[3]。研究發(fā)現(xiàn),MYL1、MYL3 和MYL6B 與內(nèi)蒙古絨山羊的肉質(zhì)特性形成相關(guān),免疫組化分析結(jié)果顯示,MYL3 的表達比例可能作為肌肉韌性的潛在分子標(biāo)記[13]。MYL1 和MYL3 在骨骼肌中的表達水平較高,此外發(fā)現(xiàn)MYL1 基因具有 2個 TATA box,推測MYL1 是綿羊骨骼肌組織特異性表達的基因[30]。MYL3 主要在牛肌原纖維的粗肌絲中表達,編碼蛋白的表達水平隨生長月齡的變化呈現(xiàn)遞增趨勢[23],主要與調(diào)控肌肉生長發(fā)育的相關(guān)蛋白相互作用[31]。MYL4 與肌動蛋白單體結(jié)合相關(guān),是控制大鼠心房收縮、電性和結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵基因[32],其功能障礙會導(dǎo)致嚴重的遺傳性心房心肌病[33]。本研究發(fā)現(xiàn),MYL4 在綿羊心臟組織中特異性高表達,推測該基因在綿羊心臟功能維持中具有重要作用。

RLC 型肌球蛋白主要參與肌肉纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和肌肉功能的調(diào)節(jié),它的變化可以影響肌肉的適應(yīng)性和功能[4]。RLC 型家族成員有MYL2、MYL7、MYL10、MYLPF、MYL9、MYL12A 和MYL12B。其中,MYL9 和 MYL12B 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)相似。研究發(fā)現(xiàn),豬肌生成抑制素基因(myostatin,MSTN)敲除后,MYL9 mRNA 和蛋白的表達水平顯著上調(diào),表明MYL9 在豬骨骼肌的生長和發(fā)育中起著重要作用,并推測MYL9 可能通過控制 ATP 酶活性來調(diào)節(jié)肌肉能量代謝,或者與肌凝蛋白相互作用間接參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控[10]。Deeg 等[34]證明了MYL12A 是維持雞外周血單個核細胞和溶菌酶細胞完整性所必需的基因。MYL12B 是細胞骨架的重要組分[35],作為肌球蛋白的調(diào)節(jié)性輕鏈,可通過調(diào)節(jié)輕鏈的磷酸化與去磷酸化來參與調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)。MYL9 和MYL12B 在湖羊各個組織中廣泛表達,表現(xiàn)出相近的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機制。

MYL2 和MYLPF在湖羊胸肌等骨骼肌中高表達,MYL10 在各組織中低表達。MYL2 是肌纖維再生的敏感標(biāo)記物[36],與MYL10 編碼的蛋白共同調(diào)控形成緊密連接、黏著斑和肌動蛋白細胞骨架[37]。MYL7 表達水平的變化與唐氏綜合征患者的先天性心臟病密切相關(guān)[5],本研究發(fā)現(xiàn)MYL7 在湖羊心臟中呈現(xiàn)特異性高表達。MYLPF在山羊背最長肌、腓腸肌和腹肌中表達水平高,而在肝、脾、肺和腎中表達水平低,且骨骼肌中MYLPF的表達量隨著年齡增長而逐漸減少,說明MYLPF在骨骼肌的生長和分化發(fā)育中具有重要作用[3]。綿羊種內(nèi)共線性分析揭示了 2 對(MYL2-MYL10、MYL2-MYLPF)基因片段復(fù)制現(xiàn)象。生物進化過程中,片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)有助于加速基因家族的擴張,為獲取新的基因功能提供機會[38]。基因在復(fù)制過程中發(fā)生遺傳變異,引起功能分歧,隨后純化選擇,這些功能被保留下來[39]。

基因的表達在一定程度上揭示了基因的潛在功能[40],為進一步挖掘與綿羊肌肉發(fā)育相關(guān)的基因,本研究根據(jù)湖羊MYLs的多組織表達模式分析結(jié)果,挑選出在肌肉中高水平表達的家族成員。利用 qRT-PCR 技術(shù),檢測了處于育種過程中的軍墾白肉羊各組織的基因表達變化,并與湖羊各組織的檢測對比結(jié)果相似,其中MYL1、MYL6B 和MYLPF在軍墾白肉羊肌肉中的表達水平也顯著高于其他組織(P<0.000 1)。軍墾白肉羊是新疆農(nóng)墾科學(xué)院選育的、適應(yīng)工廠化養(yǎng)殖的良種肉羊群體,其產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)優(yōu)良。本研究比較了MYL1、MYL6B 和MYLPF基因在軍墾白肉羊、湖羊和細毛羊這3個不同品種綿羊的表達差異,發(fā)現(xiàn)以上基因在軍墾白肉羊骨骼肌中的表達顯著高于湖羊和細毛羊(P<0.000 1)。同時,還比較了3個品種綿羊肝臟中MYL1、MYL6B 和MYLPF的表達情況,發(fā)現(xiàn)MYL1 在軍墾白肉羊和湖羊的表達水平顯著低于細毛羊(P<0.000 1),而MYL6B 在軍墾白肉羊和細毛羊的表達水平顯著低于湖羊(P<0.000 1)。肝臟是脂肪分解代謝的重要器官。推測MYL1 和MYL6B 在軍墾白肉羊肝臟中的低水平表達,可能影響脂肪沉積,有利于肌內(nèi)脂肪的形成。這些發(fā)現(xiàn)對于深入了解綿羊肉質(zhì)形成的分子機制具有重要意義,并為今后通過遺傳改良提高綿羊的肉質(zhì)提供了新的候選基因。

4 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)在綿羊基因組中鑒定出了 12個MYLs基因,并對該家族成員進行理化性質(zhì)、遺傳進化和表達模式分析,發(fā)現(xiàn)MYL家族基因在綿羊不同組織表達具有特異性,其中MYL1、MYL6B 和MYLPF在肌肉中表達水平顯著高于其他組織,研究結(jié)果為進一步探討MYL基因家族與綿羊肌肉生長發(fā)育的關(guān)系提供了科學(xué)基礎(chǔ)。