牦牛六個多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OSKMNL的克隆和多順反子慢病毒載體的構(gòu)建

黃顯朋,邢嘉儀,白媛媛,姜雨婷,麻志偉,付 偉,2,蘭道亮,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院,成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室,成都 610041)

胚胎干細胞是從哺乳動物內(nèi)細胞團分離得到的具有無限增殖和發(fā)育多能性的細胞[1]。但胚胎干細胞涉及倫理性問題,因此需要另一種方法獲得具有胚胎干細胞類似功能的細胞。在體細胞核移植和細胞融合的基礎(chǔ)上,有研究者猜測可能是胚胎干細胞的某些因子誘導了體細胞的多能性[2]。而研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL)對胚胎干細胞多能性維持具有重要作用[2-3]。基于這些理論,Takahashi和Yamanaka[2]將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子導入成年小鼠的成纖維細胞中,成功誘導出了胚胎干細胞樣的細胞,并命名為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。2007年Yu等[4]也通過Oct4、Sox2、Nanog、Lin28誘導出人iPSC。iPSC與胚胎干細胞相似,具有無限的自我更新和增殖能力,能夠分化成3個生殖層的所有細胞類型[2,4]。近年來,科學家們基于OSKM這4個轉(zhuǎn)錄因子已成功將小鼠[2]、豬[5-6]、犬[7]、山羊[8-9]、牛[10]等動物的體細胞重編程為iPSC。但在誘導大型家畜時,有研究發(fā)現(xiàn)OSKM四個因子無法誘導產(chǎn)生iPSC或產(chǎn)生的iPSC不能穩(wěn)定傳代[11-12]。特別是在誘導反芻動物iPSC時,更多的研究是在OSKM四個因子的基礎(chǔ)上添加額外的因子,比如Nanog和Lin28[13-14]。另外,外源基因的來源對誘導效率也有影響。在誘導過程中使用異源基因比使用本源動物的基因誘導效率低[15-17],并且使用本源動物的基因可以獲得較為理想的多能性狀態(tài)[6]。可能不同物種基因氨基酸序列的不同導致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)差異,進而影響誘導效率[18]。

牦牛作為科學研究中重要的生物模型,能夠生活在缺氧、寒冷、環(huán)境惡劣的高海拔地區(qū),是我國優(yōu)良的遺傳資源,同時也是我國高寒牧民主要的經(jīng)濟來源,為牧民提供肉、乳、皮等基本生活資料[19]。由于牦牛生產(chǎn)體系不健全,畜群結(jié)構(gòu)不合理,缺乏對優(yōu)良品種的保護和利用,我國的牦牛出現(xiàn)繁殖率低、繁殖周期長、體重減小、抗病力弱等退化表現(xiàn)[20-21]。iPSC由于其來源廣泛,可以由任何細胞產(chǎn)生,并且不會涉及倫理性問題,使其在人類疾病治療、藥物開發(fā)、再生醫(yī)學研究等領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)越性[22-23]。不僅如此,iPSC還可以為轉(zhuǎn)基因育種和轉(zhuǎn)基因家畜提供寶貴的工具,對于我國良種家畜的推廣和畜牧業(yè)經(jīng)濟效益的提高以及遺傳資源的保護具有積極的作用[24-25]。傳統(tǒng)的保護動物遺傳資源的方法有活體保存、冷凍技術(shù)、基因文庫保存、分子遺傳標記等[26],iPSC的凍存也是保護動物遺傳資源的方法之一。另外,iPSC還可以在體外誘導分化為生殖細胞或作為體細胞克隆技術(shù)中的核供體,與基因編輯結(jié)合,用于生產(chǎn)生產(chǎn)性能優(yōu)良、抗病力強的轉(zhuǎn)基因動物,加速動物品種改良[25]。當前還沒有關(guān)于牦牛iPSC的相關(guān)研究,研究牦牛iPSC或許對牦牛品種改良和遺傳資源保護具有積極作用。

本研究克隆了牦牛Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL)六種轉(zhuǎn)錄因子,將OSM和KNL分別插入兩個慢病毒載體,構(gòu)建了FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry兩種多順反子慢病毒載體,并將得到的病毒感染牦牛成纖維細胞進行驗證。為后續(xù)利用OSKMNL將牦牛體細胞重編程為iPSC奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol(北京全式金生物科技有限公司,ET111-01-V2)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(成都蓉為基因生物科技有限公司,A502-02)、TaKaRa LA Taq with GC Buffer(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司,RR02AG)、膠回收試劑盒(OMEGA,D2500-01)、pMD19-T載體(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司,6013)、DH5α感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司,CB101)、質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司,DP103)、FUW-tetO-MCS(武漢淼靈生物科技有限公司,P48786)、PSPAX2(成都傳世科為生物技術(shù)有限公司,Trans1-52)、PMD2.G(成都傳世科為生物技術(shù)有限公司,Trans1-53)、3～5月齡牦牛胎兒由西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院付偉老師贈送。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 從-80 ℃取出牦牛胎兒,剪刀剪開牦牛胎兒腹壁,從兩側(cè)取出白色米粒狀的生殖嵴組織,液氮研磨后用Trizol提取組織總RNA,經(jīng)微量核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度和質(zhì)量,經(jīng)PCR鑒定后,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank報道的牛、瘤牛、水牛、豬、山羊、綿羊、小鼠的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28基因序列,經(jīng)多序列比對,發(fā)現(xiàn)它們的編碼區(qū)兩端保守,參照NCBI中牛的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28基因序列設(shè)計克隆引物(表1),慢病毒表達載體引物根據(jù)2A肽序列和基因序列設(shè)計(表2),引物由北京擎科生物技術(shù)股份有限公司合成。

表1 基因引物信息Table 1 Primers information of genes

表2 表達載體引物信息Table 2 Primers information of expression vectors

1.2.3 牦牛OSKMNL基因的克隆 以上述cDNA為模板,用各基因的上下游引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系和程序按照 LA Taq with GC Buffer試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單菌落擴大培養(yǎng),經(jīng)菌液PCR鑒定后,將陽性菌液送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 牦牛OSKMNL基因的序列分析 測序結(jié)果用SnapGene進行多序列比對,DNASTAR進行序列拼接得到OSKMNL基因序列。使用NCBI的BLAST比對核苷酸和氨基酸序列,進化樹由MEGA7中的鄰接法構(gòu)建,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通過生物在線分析軟件SMART預(yù)測。

1.2.5 慢病毒載體FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry的構(gòu)建 質(zhì)粒FUW-TETO-MCS、pCMV-mCherry-MCS-Neo、FUW-EGFP分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑單菌落擴大培養(yǎng)并提質(zhì)粒,-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e用表2的引物擴增出Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、EGFP、mCherry基因,用1%的瓊脂糖凝膠分離后膠回收,-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)粒FUW-TETO-MCS用BamH Ⅰ和XbaⅠ雙酶切后膠回收,-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑諢o縫克隆試劑盒說明書連接FUW-teto-OSM-EGFP慢病毒載體,FUW-TETO-MCS、Oct4、Sox2、c-Myc、EGFP按照摩爾比1∶1∶1∶1∶1加入反應(yīng)體系,50 ℃連接30 min。

FUW-teto-KNL-mCherry載體與前面一樣進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單菌落擴增并進行PCR檢測,將陽性菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.6 慢病毒載體的包裝 轉(zhuǎn)染前1 d,將293 T細胞傳代到10 cm皿,待細胞密度達到70%～90%,將培養(yǎng)基換為Opti-MEM,準備6只管,分別加入1.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基,向前3管分別加入質(zhì)粒FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry和FUW-M2rtTA,每管再加入包裝質(zhì)粒PSPAX2、PMD2.G,比例為4∶3∶1。另外3管加入lipo2000,室溫孵育5 min。然后將兩管溶液混合,室溫孵育20 min,均勻滴加到293T細胞中。培養(yǎng)6 h后換取正常培養(yǎng)基。收集48 和72 h的細胞上清液,離心、過濾、濃縮、分裝后,-80 ℃保存。

1.2.7 慢病毒感染293T細胞 感染前1 d取生長狀態(tài)良好的細胞接種六孔板,第2天進行病毒感染。試驗分為感染病毒組和空白對照組。分別取FUW-teto-OSM-EGFP、FUW-teto-KNL-mCherry和FUW-M2rtTA三種病毒各10 μL,混合后感染293T細胞,并加入8 μg·mL-1的polybrene,24 h后換液。72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.8 慢病毒感染牦牛成纖維細胞 按“1.2.7”的方法感染牦牛成纖維細胞,72 h后觀察熒光表達情況。并提取感染72 h后成纖維細胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,用RT-PCR檢測外源OSKMNL基因的表達。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛OSKMNL基因PCR擴增結(jié)果

以牦牛胎兒生殖嵴組織cDNA為模板,用RT-PCR擴增牦牛OSKMNL基因,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示牦牛OSKMNL基因編碼區(qū)大小分別為1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp(圖1)。

A. Oct4; B. Sox2; C. Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28。M. DNA相對分子質(zhì)量標準; 1. PCR產(chǎn)物A. Oct4; B. Sox2; C.Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28. M. 2000 Marker; 1. PCR product圖1 基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of desired genes

2.2 牦牛OSKMNL菌液PCR結(jié)果

挑取疑似陽性的菌落到液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)12 h,吸取1 μL菌液進行PCR驗證,挑取的菌落都得到了一條清晰的條帶(圖2)。

A. Oct4; B. Sox2; C. Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28。M.DNA相對分子質(zhì)量標準;1～4.菌液PCR產(chǎn)物A. Oct4; B. Sox2; C. Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28. M.2000 Marker;1-4.Bacteria solution PCR products圖2 菌液PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of bacteria solution

2.3 牦牛OSKMNL基因的序列

將測序結(jié)果用DNASTAR拼接得到牦牛OSKMNL基因的序列(圖3)。

A.Oct4; B.Sox2; C.Klf4; D.c-Myc; E.Nanog; F.Lin28圖3 牦牛OSKMNL基因序列信息Fig.3 Sequence information of yak OSKMNL genes

2.4 牦牛OSKMNL基因的序列分析和進化樹構(gòu)建

將拼接得到的序列與黃牛、瘤牛、水牛、豬、山羊、綿羊、狗、貓、小鼠進行比對,結(jié)果顯示牦牛OSKMNL核苷酸序列與黃牛的同源性在99%以上。牦牛OSKMNL氨基酸序列與黃牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc與黃牛的同源性為100%。與其它物種的同源性見圖4。進化樹結(jié)果顯示牦牛與黃牛、瘤牛、水牛的親緣關(guān)系最近,與小鼠的親緣關(guān)系最遠(圖4)。

A. Oct4; B. Sox2; C. Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28圖4 牦牛OSKMNL基因同源性分析和進化樹圖譜Fig.4 Homology analysis and phylogenetic tree of yak OSKMNL genes

2.5 牦牛OSKMNL基因的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

用生物在線分析軟件SMART對牦牛OSKMNL基因的蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)牦牛Oct4具有1個POU結(jié)構(gòu)域和1個HOX結(jié)構(gòu)域,以及3個低重復(fù)序列。Sox2含有1個HMG結(jié)構(gòu)域和3個低重復(fù)序列。Klf4含有3個Znf-C2H2結(jié)構(gòu)以及4個低重復(fù)序列。c-Myc含有1個Pfam結(jié)構(gòu)和1個HLH結(jié)構(gòu),以及1個低重復(fù)序列。Nanog含有1個HOX結(jié)構(gòu)和2個低重復(fù)序列。Lin28含有1個CSP結(jié)構(gòu)和2個Znf-C2H2結(jié)構(gòu),以及1個低重復(fù)序列(圖5)。

A. Oct4; B. Sox2; C. Klf4; D. c-Myc; E. Nanog; F. Lin28圖5 牦牛各基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Proteins structure prediction of each gene in yak

2.6 慢病毒載體FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry的構(gòu)建

以上試驗克隆得到了牦牛OSKMNL這6個特異性基因,以3個基因為一組構(gòu)建了包含Oct4、Sox2、c-Myc三個基因的FUW-teto-OSM-EGFP質(zhì)粒和包含Klf4、Nanog、Lin28三個基因的FUW-teto-KNL-mCherry質(zhì)粒,將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,每個質(zhì)粒挑取5個菌落做PCR驗證,都得到了一條清晰的條帶(圖6、圖7)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準;1～5.FUW-teto-OSM-EGFP菌液PCR結(jié)果(4 317 bp);6～10.FUW-teto-KNL-mCherry菌液PCR結(jié)果(3 897 bp)M. 10 000 Marker;1-5. Result of FUW-teto-OSM-EGFP bacteria solution PCR(4 317 bp);6-10.Result of FUW-teto-KNL-mCherry bacteria solution PCR(3 897 bp)圖6 慢病毒載體PCR結(jié)果Fig.6 PCR results of lentiviral vectors

A. FUW-teto-OSM-EGFP;B. FUW-teto-KNL-mCherry圖7 慢病毒載體結(jié)構(gòu)Fig.7 The structure of lentiviral vectors

2.7 慢病毒包裝

利用lipo2000將構(gòu)建的FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,72 h后在熒光顯微鏡下看到綠色和紅色熒光表達,證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功(圖8)。

A.FUW-teto-OSM-EGFP載體;B.FUW-teto-KNL-mCherry載體A.FUW-teto-OSM-EGFP vector;B.FUW-teto-KNL-mCherry vector圖8 慢病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.8 Transfection results of lentiviral vectors

2.8 慢病毒感染293T細胞

將包裝好的慢病毒感染293T細胞,72 h后在熒光顯微鏡下可以看到慢病毒感染組發(fā)綠色和紅色熒光,空白對照組沒有熒光(圖9)。說明包裝的病毒具有感染活力。

A.試驗組;B.對照組A.Experimental group; B. Control group圖9 感染后293T細胞熒光蛋白表達Fig.9 Expression of fluorescent proteins in infected 293T cells

2.9 慢病毒感染牦牛成纖維細胞

將慢病毒感染牦牛成纖維細胞,72 h后可以看到感染病毒的成纖維細胞發(fā)綠色和紅色熒光,而空白對照組不發(fā)熒光(圖10)。RT-PCR結(jié)果顯示,試驗組有預(yù)期大小的條帶,對照組沒有條帶(圖11)。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry兩個慢病毒載體,并能感染牦牛成纖維細胞。

A.試驗組;B.對照組A. Experimental group; B.Control group圖10 感染后牦牛成纖維細胞熒光蛋白表達Fig.10 Expression of fluorescent proteins in infected BEFs

3 討 論

家畜多能干細胞的分離、培養(yǎng)和建系對家畜的品種改良和資源保護具有積極作用,但在大型家畜中建立干細胞系難度較大。誘導多能干細胞的產(chǎn)生使得建系困難的家畜建立干細胞系成為可能。目前多種動物已成功建立iPSC。尤其是豬iPSC已成功用于產(chǎn)生嵌合體豬[27]和克隆豬[28],這為家畜誘導多能干細胞用于動物品種改良和種質(zhì)資源保護提供了有利的證據(jù)。本研究針對牦牛6個多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OSKMNL進行了克隆、蛋白結(jié)構(gòu)分析與慢病毒載體構(gòu)建,推動多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OSKMNL在牦牛干細胞中的應(yīng)用,以及為后續(xù)研究牦牛iPSC做準備。

研究表明,多能性相關(guān)因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28在多能干細胞中表達,比如胚胎干細胞(ESC)、原始生殖細胞(PGC)等,它們對多能干細胞的維持和調(diào)節(jié)起著重要作用[29-30]。本研究從牦牛胎兒生殖嵴組織克隆了牦牛OSKMNL基因,并對其基因序列進行分析,發(fā)現(xiàn)不同物種間OSKMNL基因在進化上是保守的,這與以前的研究結(jié)果相同[13,31-32]。然后用SMART在線分析軟件對OSKMNL的蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析,發(fā)現(xiàn)牦牛OSKMNL基因都含有該基因家族所特有的相應(yīng)蛋白功能的結(jié)構(gòu),比如POU結(jié)構(gòu)域、HOX結(jié)構(gòu)域、HMG結(jié)構(gòu)域、Znf-C2H2結(jié)構(gòu)域、HLH結(jié)構(gòu)域、CSP結(jié)構(gòu)域等。POU結(jié)構(gòu)域、HOX結(jié)構(gòu)域和HMG結(jié)構(gòu)域都是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。含有這3個結(jié)構(gòu)域的Oct4、Sox2、Nanog是多能干細胞維持的核心因子,它們常常單獨或協(xié)同調(diào)控下游靶基因的表達。研究表明,在干細胞中Oct4有623個靶位點,Sox2有1 279個靶位點,而Oct4和Sox2共同的靶位點有404個,Oct4、Sox2和Nanog共同的靶位點是353個[33]。Znf-C2H2結(jié)構(gòu)域不僅可以結(jié)合DNA,還可以結(jié)合RNA和蛋白質(zhì)。它和基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA的運輸、蛋白結(jié)構(gòu)的形成等相關(guān)[34]。而含有Znf-C2H2結(jié)構(gòu)域的Klf4對干細胞的自我更新具有重要作用[35]。HLH結(jié)構(gòu)域是c-Myc的主要功能區(qū),含有一個環(huán)和兩個螺旋,較大的螺旋含有DNA結(jié)合區(qū)域,可以和E-box結(jié)構(gòu)結(jié)合,調(diào)控基因的表達,與干細胞的自我更新和譜系分化能力有關(guān)[36]。當敲除干細胞中的c-Myc時可以明顯看到蛋白質(zhì)和核酸合成減少,細胞出現(xiàn)停滯狀態(tài)[37]。CSP結(jié)構(gòu)域是一種RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,含有這種結(jié)構(gòu)域的Lin28可以通過抑制let-7 microRNA并影響mRNA翻譯,從而調(diào)節(jié)哺乳動物胚胎干細胞的自我更新[38]。對牦牛OSKMNL基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)的分析,為后續(xù)研究OSKMNL基因在牦牛干細胞中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

以往的研究表明,在對原代細胞進行轉(zhuǎn)基因操作時,其轉(zhuǎn)染效率低下[39-40]。選擇合適的轉(zhuǎn)染方法是成功將外源基因?qū)朐毎年P(guān)鍵。慢病毒載體憑借其高效的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定表達外源基因現(xiàn)已廣泛用于基因轉(zhuǎn)導研究和基因治療[41-42]。本研究以慢病毒載體FUW為基本骨架,構(gòu)建了包含牦牛6個多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。另外,本研究構(gòu)建的兩個載體包含綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白,后續(xù)感染細胞時能實時觀察病毒的感染情況。慢病毒的構(gòu)建為后續(xù)誘導牦牛iPSC的研究做了相應(yīng)的準備。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了牦牛的6個多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OSKMNL;構(gòu)建了分別攜帶牦牛3個轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包裝的慢病毒能感染牦牛成纖維細胞。有利于推動多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OSKMNL在牦牛干細胞中的應(yīng)用,也為后續(xù)研究牦牛iPSC做了準備。