基于多組學與網絡藥理學探究淫羊藿對后備母豬發情的作用

徐俊杰,張璐通,王津潔,陳曉晨,何偉先,蔡傳江,褚瑰燕,楊公社*

(1.西北農林科技大學動物科技學院,楊凌 712100;2.齊全農牧集團股份有限公司,遂寧 629000)

我國是世界第一養豬大國,生豬產業是否健康發展關乎民生。后備母豬的繁殖生產性能直接影響整個豬群的生產性能和經濟效益[1-2]。當前,國內能繁母豬因為發情等繁殖障礙導致淘汰率居高不下,來自一個規模豬場的生產數據表明:統計2018年全年度淘汰的后備/斷奶母豬21 497頭,在后備狀態由于發情障礙導致的淘汰占比25.66%,第一胎豬由于發情障礙導致的淘汰占18.96%,這兩個階段由于發情障礙導致的淘汰最高。母豬發情與卵巢密切相關,卵泡經由原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡、優勢卵泡的發育過程,最終排卵。伴隨著卵泡的發育,雌激素分泌量上升,促進母豬出現發情行為。淫羊藿是我國一種傳統中草藥,被中醫藥列入“催情和催乳藥物”類別。淫羊藿是多年生草本藥物,含有多種黃酮類物質,全草入藥,全國大部分地區有分布,具有補腎壯陽,祛風止痛,催情等功效。相關的研究表明,淫羊藿能治療女性卵巢早衰[3]。淫羊藿的主要成分淫羊藿苷能夠在豬卵泡的體外培養中抑制顆粒細胞的凋亡從而抑制卵泡的閉鎖[4]。淫羊藿已經廣泛在生產中作為母豬促發情藥物使用[5-6],而淫羊藿對母豬發情的具體作用及作用機制尚不明晰。本試驗旨在通過活體試驗結合轉錄組學、代謝組學及網絡藥理學,揭示淫羊藿對后備母豬發情和卵巢的作用和潛在機制,為淫羊藿提高后備母豬發情利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選擇發育成熟且符合配種條件的后備待配二元母豬32頭(對照組16頭、試驗組16組),隨機分成兩組,體重(99.547±1.987)kg,210～220日齡。基礎日糧參考NRC2012哺乳期營養進行配制(每日定量3.0 kg),對照組飼喂基礎日糧,試驗組在飼喂基礎日糧的基礎上補充淫羊藿提取物(四川恒瑞通達生物)50 mg·d-1。試驗飼喂28 d,期間統計發情情況。飼喂結束每組屠宰4頭,收集血液、卵巢用于后續檢測。其余豬配種,跟蹤母豬繁殖性能。

1.2 生殖激素檢測

頸靜脈采血,通過ELISA試劑盒檢測血清中FSH(H101-1-2,南京建成)、E2(H102-1-2,南京建成)和LH(H206-1-2,南京建成)的含量。

1.3 卵巢轉錄組測序

RNA提取:使用TRlzol試劑(Life technologies,California,USA)提取卵巢總RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE)測量RNA濃度和純度。使用安捷倫生物分析儀2100系統的RNA Nano 6000檢測試劑盒(安捷倫技術公司,CA,USA)評估RNA完整性。使用NEBNext UltraTM RNA生成測序文庫。用AMPure XP系統純化PCR產物,并在Agilent Bioanalyzer 2100系統上評估文庫質量。使用DESeq2進行差異表達分析,使用Benjamini和Hochberg的方法來調整得到的P值。通過DESeq2發現的調整后P<0.05的基因為差異表達基因。依據差異基因表達量,利用R語言的Pheatmap軟件包對差異基因進行聚類分析。利用R語言的ggplot2包進行繪圖。

1.4 卵巢代謝組測序

代謝組學分析的LC/MS系統由Waters Acquity I-Class PLUS超高性能液體串聯Waters Xevo G2-XS QTof高分辨率質譜儀組成。通過MassLynx V4.2采集一次和二次質譜數據。原始數據由Proggenesis QI軟件處理,進行峰提取、峰比對等數據處理操作,基于Proggenesis QI軟件在線METLIN數據庫和Biomark自建庫進行鑒定。使用總峰面積對原始峰面積信息進行歸一化,使用MetaboAnalystR包進行差異分析。利用R語言的ggplot2包進行繪圖。

1.5 淫羊藿潛在有效成分、潛在靶點篩選與網絡構建

利用TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/)以淫羊藿為關鍵詞進行檢索,以口服利用度(OB)與類藥性(DL)為指標進行篩選(OB>30%,DL≥0.18),篩選得到淫羊藿潛在有效成分。以篩選得到的淫羊藿潛在有效成分為對象,利用swiss數據庫(http://swisstargetprediction.ch/)預測成分的潛在作用靶點 (Probability>0.1)。以卵巢早衰(POI)和月經不調(MI)為檢索詞,利用OMIM數據庫(https://www.omim.org/)與GeneCards 數據庫(https://www.genecards.org/)分別進行檢索,得到POI和MI相關靶點。將得到的淫羊藿潛在靶點與卵巢早衰相關靶點分別在UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org/)規范化后,利用venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行交集分析,即得淫羊藿作用卵巢的潛在靶點。將篩選得到的淫羊藿潛在靶點錄入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)繪制PPI(protein protein interaction)網絡。將其數據導入Cytoscape 3.7.1軟件中進行拓撲分析,根據等級值 (degree) 排名,得到這個網絡中的樞紐蛋白,即為淫羊藿作用卵巢的核心靶點。

1.6 分子對接

在RCDB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載候選靶點蛋白質三維結構,在TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/)下載候選化合物三維結構。通過CB-DOCK2在線軟件(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)進行分子對接,得到分子對接圖與Vina Score。Vina Score得分越低,表明分子結合能力更強。

1.7 KEGG與GO富集分析

用在線軟件DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選的差異基因進行GO和KEGG分析,根據校正P值進行篩選。

1.8 數據分析

試驗數據使用GraphPad Prime 8進行分析。結果用“平均值±SEM”表示,并包括至少3個獨立的生物重復(n=3)。雙尾非配對Studentt檢驗用于比較兩個試驗組。Dunnett檢驗和Sidak檢驗分別用于單因素方差分析的事后檢驗。P<0.05和P<0.01的統計學顯著值分別用(*)和(**)表示。

2 結 果

2.1 淫羊藿對后備母豬繁殖性能及血清激素的作用

飼喂淫羊藿28 d后,統計后備母豬的發情率。

收集血液進行激素測定。結果發現,試驗組后備母豬整體發情時間提前,在D6-D10的發情數量高于對照組(圖1A)。對照組平均到達發情天數為(12.313±1.003)d,試驗組平均到達發情天數為(10.813±1.054)d(圖1B)。對于配種母豬進行生產數據追蹤,結果發現,淫羊藿飼喂后母豬的產仔數、活仔數與仔豬斷奶窩重均無顯著變化,但存在上升趨勢(圖1C,D和E)。血液中的FSH、E2、LH均顯著高于對照組(P<0.05)(圖1F,G和H)。以上結果表明淫羊藿飼喂能夠促進母豬發情,并可能存在改善母豬繁殖性能的潛在作用。

A. 飼喂淫羊藿后出現發情時間統計;B. 對照組與試驗組平均到達發情時間;C、D、E. 飼喂淫羊藿25 d后,母豬該胎次產仔數(C)、活仔數(D)、仔豬斷奶窩重(E);F、G、H. 飼喂25 d后,母豬血清FSH(F)、E2(G)、LH(H)水平。*. P<0.05A. Statistics of estrus occurrence time after feeding epimedium; B. The average arrival time to estrus in the control group and the treamtment group; C, D, E. After feeding epimedium for 25 days, the litter size (C), live litter size (D), and weaning litter weight (E) of the gilts at that parity were determined; F, G, H. After 25 days of feeding, the serum hormone levels of FSH (F), E2 (G), LH (H) were measured in gilts.*. P<0.05圖1 淫羊藿飼喂對后備母豬繁殖性能與血清激素的影響Fig.1 Effect of epimedium feeding on reproductive performance and serum hormones of gilts

2.2 淫羊藿對卵巢轉錄組的影響

為了揭示淫羊藿對母豬發情促進作用的潛在機制,收集母豬卵巢進行轉錄組測序。通過 edgeR 包進行差異表達分析,將P<0.05,并且|Fold Change|>1的基因認為是顯著差異基因。根據差異基因的表達量繪制 mRNA 火山圖(圖2A)和差異 mRNA熱圖(圖2B)。其中檢測出差異 mRNA 共 1 231個,其中 477 個上調,754 個下調。為了進一步明確淫羊藿對卵巢的功能,本研究對差異 mRNA進行了功能富集分析(圖2C)和信號通路富集分析(圖2D)。結果,GO 富集分析發現,差異的 mRNA 主要富集在運輸囊泡、脂肪細胞分化、節律行為、發情周期等過程;KEGG 富集分析發現,差異的 mRNA 主要富集在緊密連接、碳水化合物代謝、刺猬信號通路、GnRH分泌和PI3K-AKT信號通路等信號通路。

A. 差異基因火山圖;B.差異基因熱圖;C.差異基因GO分析;D.差異基因KEGG分析A.Differential genes volcano map; B. Differential genes heatmap; C. Differential genes GO analysis; D. Differential genes KEGG analysis圖2 淫羊藿飼喂對后備母豬卵巢轉錄組的影響Fig.2 Effect of epimedium feeding on the ovarian transcriptome of gilts

2.3 淫羊藿對卵巢代謝組的影響

通過卵巢代謝組測序分析淫羊藿對卵巢代謝物的影響。PCoA主成分分析與差異代謝物熱圖表明,對照組和淫羊藿飼喂組卵巢代謝物組成有明顯差異(圖3A和B)。進一步對差異代謝物進行分析,結果表明共有1 616個代謝物上調,1 254個代謝物下調(圖3C)。根據代謝物Fold Change篩選出差異前20名代謝物。其中上調前10代謝物為甘草異黃酮A、西色林、阿扎螺酸3、匹普拉汀、鼠李糖苷3-蕓香糖苷、司格列肽、二-脫乙酰基腺內酯、甲硫腺苷亞砜、TCTAP、甘草瑞酮。下調前10代謝物為車葉草苷、二氧苔蘚素、半乳糖酸、脂質X、(R)-3-氨基-2-氟丙基磷酸酯、3-O-甲基鳥苷、3-甲硫基異丙基硫代葡萄糖苷、(11Z,14Z)-3-二十碳-11,14-二烯酰肉堿、紅景天苷和3-羥基十六碳二烯酰肉堿(圖3D)。KEGG富集分析表明,差異代謝物主要富集在α-亞麻酸代謝、ATP轉運蛋白、亞油酸代謝、β-丙氨酸代謝、氨基苯甲酸鹽降解、生物素代謝、泛醌和其他萜醌的生物合成、咖啡因代謝、核黃素代謝、異黃酮生物合成、氨基-tRNA生物合成,甾體降解、多種生物堿的生物合成、PPAR信號通路、鞘脂信號通路等通路(圖3E和F)。

A. 卵巢代謝組PCoA分析;B. 差異代謝物熱圖;C. 差異代謝物火山圖;D. TOP20差異代謝;E. 差異代謝物KEGG分析;F. 富集KEGG網絡圖A. Ovarian metabolomic PCoA analysis; B. Differential metabolites heat map; C. Differential metabolites volcano map; D. TOP20 differential metabolism; E. Differential metabolites KEGG analysis; F. Enrich the KEGG network diagram圖3 淫羊藿飼喂對后備母豬卵巢代謝組的影響Fig.3 Effect of epimedium feeding on ovarian metabolome of gilts

2.4 基于網絡藥理學篩選淫羊藿對卵巢調控的潛在靶點

使用TCMSP 數據庫以淫羊藿為關鍵詞進行檢索,篩選后得到22個有效成分(表1)。使用swiss數據庫預測以上22 個成分的潛在靶點(Probability>0.1)共478個。與檢索所得4 353個卵巢早衰和月經不調相關靶點取交集,即得淫羊藿治療卵巢早衰的潛在作用靶點161個(圖4A)。通過String軟件進行蛋白互作分析得到的網絡圖中共有161個節點,636條連線,平均節點度7.9,平均局部聚類系數0.526,PPI富集P值<1.0×10-16(圖4B)。通過Cytoscape軟件對PPI互作網絡進行分析,得到degree大于等于20的蛋白共18個作為核心靶點,根據得分依次為TP53、SRC、AKT1、CCND1、TNF、ESR1、EP300、ERBB2、JAK2、PARP1、CCNB1、PIK3CD、CDK2、CCNA2、MAPK3、CDK4、MAPK1和CDK1(圖4C)對135個作用靶點進行GO分析與KEGG分析,結果表明,淫羊藿參與雌性疾病的靶點主要參與了蛋白磷酸化、MAPK級聯反應的正調控、生物節律、基因表達的正調控、細胞凋亡過程的負調控、細胞內鈣離子濃度的正調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控等生物學過程;參與核、細胞質、細胞周期依賴性蛋白激酶全酶復合物、受體復合物、核原形質核漿和質膜整體成分等細胞組分;參與ATP結合、蛋白激酶活性、RNA聚合酶II轉錄因子活性、轉錄共激活因子結合、鋅離子結合和蛋白質結合等分子功能(圖4D)。KEGG分析結果顯示,靶點蛋白信號通路富集在PI3K-AKT信號通路、細胞周期、細胞衰老、HIF-1信號通路、孕激素介導的卵母細胞成熟、Fox0信號通路、cAMP信號通路、細胞凋亡、結核病、雌激素信號通路、鈣信號通路、AMPK信號通路、子宮內膜癌和卵母細胞減數分裂等途徑(圖4E)。進一步對核心靶點進行分子對接預測,根據Vina Score選擇每個靶點蛋白最優候選化合物進行分子對接(圖5A-J)。

表1 淫羊藿潛在有效成分Table 1 Potential active ingredients of epimedium

(圖4續 Continued)A. 卵巢早衰與月經不調疾病靶點與淫羊藿有效物質靶點韋恩圖;B. 共有靶點蛋白的蛋白互作網絡圖;C. 內圈蛋白質為degree≥20的核心蛋白;D. 共有蛋白的KEGG信號通路富集分析氣泡圖;E. 共有蛋白的GO分析直方圖A. Venn map of targets for ovarian premature failure and menstrual disorders, as well as effective substances in epimedium; B. Protein interaction network diagram of common target proteins; C. The inner circle protein is a core protein with a degree ≥ 20; D. Bubble plot analysis of KEGG signaling pathway enrichment of shared proteins; E. GO analysis histogram of shared proteins圖4 網絡藥理學分析淫羊藿作用母豬卵巢的潛在靶點與機制Fig.4 Network pharmacological analysis of potential targets and mechanisms of epimedium on sow ovaries

A. AKT1與Icariin分子對接示意圖;B. ERBB2與8-Isopentenyl-kaempferol分子對接示意圖;C. PARP1與YinyanghuoC分子對接示意圖;D. JAK2與6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium分子對接示意圖;E. SRC與luteolin分子對接示意圖;F. PIK3CD與6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium分子對接示意圖;G. ESR1與DFV分子對接示意圖;H.TP53與Icariin分子對接示意圖;I.EP300與YinyanghuoC分子對接示意圖;J. TNF與6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium分子對接示意圖A. Schematic diagram of the docking between AKT1 and Icariin molecules; B. Schematic diagram of molecular docking between ERBB2 and 8-Isopentenyl-kaempferol; C. Schematic diagram of PARP1 docking with YinyanghuoC molecules; D. Schematic diagram of molecular docking between JAK2 and 6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno [3,4-h] isoquinolin-2-ium; E. Schematic diagram of the docking between SRC and luteolin molecules; F. Schematic diagram of PIK3CD docking with 6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno [3,4-h] isoquinolin-2-ium molecules; G. Schematic diagram of the docking between ESR1 and DFV molecules; H. Schematic diagram of TP53 docking with Icariin molecules; I. Schematic diagram of the docking between EP300 and YinyanghuoC molecules; J. Schematic diagram of the docking of TNF with 6-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-dioxo-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno [3,4-h] isoquinolin-2-ium molecules圖5 靶點蛋白與最優候選化合物分子對接圖Fig.5 Docking diagram of target proteins and optimal candidate compound molecules

3 討 論

近年來,后備母豬發情利用率低一直是限制我國生豬產業的關鍵問題。后備母豬卵巢的發育狀態以及性激素分泌水平決定了母豬發情的時間[7]。為了提高后備母豬發情利用率,淫羊藿目前已被廣泛應用于母豬發情異常的治療中,然而淫羊藿對后備母豬發情的具體功能及作用尚不明晰。因此,本研究通過淫羊藿飼喂后備母豬,利用轉錄組學、代謝組與網絡藥理學分析淫羊藿對母豬卵巢的作用及其機制,以期為淫羊藿在母豬生產中的應用提供理論依據。前人大量研究發現,淫羊藿苷對雌性生殖功能具有重要影響,本研究發現,飼喂淫羊藿能使后備母豬發情提前,血清FSH、LH和E2含量增高。相關研究報道了淫羊藿飼喂小鼠能提高血清E2和P4含量[8]。淫羊藿苷飼喂大鼠能促進卵泡發育,提高有腔卵泡數量[9]。以上研究與本研究結果一致,即淫羊藿能夠提高性激素水平,進而促進動物發情。為了探究淫羊藿是否對其他繁殖性能有影響,本研究進一步統計了飼喂淫羊藿母豬的生產性能,包括總仔數、活仔數和斷奶窩重,表明淫羊藿飼喂沒有顯著通過對轉錄組差異蛋白和潛在靶點蛋白的KEGG分析,發現PI3K-AKT信號通路均顯著富集。PI3K-AKT信號通路調節細胞生長和增殖,卵巢顆粒細胞中的氧化應激常導致PI3K-AKT信號通路下調,抑制顆粒細胞增殖,從而影響卵巢功能障礙并引起各種疾病[10]。淫羊藿苷能夠通過PI3K-AKT-MTOR途徑提高POI大鼠血清E2水平和有腔卵泡數量,降低卵泡閉鎖水平[11]。卵巢的氧化應激會引起卵泡的異常閉鎖,降低卵母細胞質量[12]。線粒體是雌二醇合成的主要場所,維持線粒體穩態對于雌激素合成至關重要,Hu等[13]發現,激活PI3K-AKT信號通路能夠促進豬卵巢顆粒細胞的雌二醇合成。淫羊藿具有抗氧化功能,此前研究了淫羊藿苷能提高軟骨細胞的SOD,緩解H2O2帶來的氧化應激損傷[14]。張越等[4]發現,淫羊藿苷能夠激活PI3K-AKT信號通路抑制卵泡體外培養的凋亡水平,減少ROS產生,提高CAT和SOD活性。以上結果表明,淫羊藿對后備母豬發情的促進作用可能通過PI3K-AKT信號通路介導的抗氧化途徑來實現的,淫羊藿的有效成分對顆粒細胞雌二醇合成的作用還需進一步驗證。

代謝組的差異代謝物TOP20中存在多種天然類黃酮類物質,如甘草異黃酮A、西色林、鼠李糖苷3-蕓香糖苷等。這表明,飼喂淫羊藿能夠使其在豬體內發生代謝,并進入卵巢發揮功能。KEGG富集分析結果顯示,差異代謝物富集在α-亞麻酸代謝、ABC轉運蛋白、亞油酸代謝、β-丙氨酸代謝等信號通路。多不飽和脂肪酸通常分為Ω-3 多不飽和脂肪酸(Ω-3PUFA)和Ω-6 多不飽和脂肪酸(Ω-6PUFA)。α-亞麻酸屬于Ω-3PUFA,小鼠缺失 PUFA 合成酶,卵泡中顆粒細胞數量顯著下降,日糧補充Ω-3PUFA可顯著增加顆粒細胞數量,促進卵泡生長[15]。Ω-3PUFA 可以使后備母豬的初情期提前[16-17],縮短經產母豬的斷奶發情間隔[18-19]。此外,日糧中補充Ω-3PUFA 也能夠顯著提高母牛卵巢的有腔卵泡數和排卵數[20],增加奶牛排卵前卵泡大小,增加血液中及卵泡液中雌激素的含量[21-22]。蘇行等[23]發現,雌二醇可以通過影響ABC轉運蛋白相關基因的表達水平促進鵝顆粒細胞增殖和脂質沉積。亞麻油屬于Ω-6PUFA,前人研究表明,母羊飼喂富含Ω-6PUFA的飼料能夠促進顆粒細胞增殖,促進母羊發情[24]。范子玲等[25]發現,β-丙氨酸在乏情奶牛中顯著降低,這表明β-丙氨酸可能參與了奶牛的卵泡發育。以上過程提示,淫羊藿飼喂后備母豬可能通過黃酮類代謝物到達卵巢,影響卵巢脂質代謝和能量代謝,進而影響卵泡發育過程。

通過TCMSP數據庫發現了22種淫羊藿的潛在有效成分,2種有效成分數據庫中沒有對應的靶點信息,其中許多物質已報道與卵巢發育和功能密切相關。槲皮素能夠降低卵巢氧化應激,緩解大鼠卵巢早衰,提高雌二醇的合成[26-27]。山柰酚能夠促進蛋雞卵巢發育[28],另有研究發現山柰酚能調節下丘腦-垂體-卵巢軸緩解PCOS的癥狀[29],谷甾醇通過PI3K-AKT信號通路促進人KGN細胞增殖,抑制凋亡[30],促進小鼠卵巢的雌二醇合成[31]。唐曉靜[32]發現,木犀草素能夠通過cAMP信號通路促進顆粒細胞雌二醇合成;張曦倩等[33]發現,木犀草素能夠通過MAPK-ERK信號通路降低小鼠卵巢MDA水平,增加SOD和CAT活性,抑制顆粒細胞氧化應激誘導的凋亡。王彥予[34]研究表明,鼠李糖苷能夠抑制卵巢癌。淫羊藿苷作為天然的非甾體類化合物,在許多植物和草本植物中廣泛存在[35],尤以催情類中草藥含量較高。它可與雌激素受體(ER)結合,發揮雌激素樣作用,副作用小[36]。以上的研究表明,淫羊藿的有效成分均對卵巢發育或維持卵巢功能具有積極作用。其余有效成分還未見相關報道,可進一步研究其對卵巢細胞的作用。

通過網絡藥理學分析發現了淫羊藿作用卵巢的18個核心靶點。ESR1、ESR2屬于雌激素受體,對于調節卵巢功能具有重要作用。CCNB1、CCNA2、CDK1、CDK2和CDK4屬于細胞周期蛋白,與細胞活力和增殖密切相關。TP53是一種轉錄因子,可以磷酸化MAPK調控細胞功能,也可作為反式激活劑參與細胞周期[37]。SRC是一種非受體酪氨酸激酶,參與控制多種生物活性的信號通路,包括基因轉錄、細胞黏附、細胞增殖、細胞凋亡等過程[38]。ERBB2(Erb-B2受體酪氨酸激酶2)在細胞核中參與轉錄調節,與PTGS5/COX-3啟動子中的2′-TCAAATTC-2′序列結合并激活其轉錄,與CDKN1A的轉錄激活有關[39]。調節外周微管(MTs)的生長和穩定[40]。腫瘤壞死因子(TNF)可以與其受體TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR結合,從而發揮作用。TNF參與調節廣泛的生物過程,包括細胞增殖、分化、細胞凋亡、脂質代謝和凝血[41]。EP300(E1A結合蛋白P300)作為組蛋白乙酰轉移酶起作用,通過染色質重塑調節轉錄,在細胞增殖和分化過程中很重要。它通過特異性結合磷酸化的CREB蛋白來介導cAMP基因調控[42]。JAK2通過STATs磷酸化啟動JAK-STAT信號通路,參與細胞生長、發育、分化或組蛋白修飾等過程[43]。PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1)參與調節細胞分化、增殖和腫瘤轉化,DNA損傷修復等過程[44]。PIK3CD(磷酸肌醇3激酶,PI3-Ks)是一類脂質激酶,能夠磷酸化磷酸肌醇環的3′OH,激活PI3K-AKT信號通路,參與細胞增殖和存活。以上結果表明,本研究預測得到的靶點蛋白對于細胞的正常生理狀態具有重要作用。以上蛋白可以作為淫羊藿影響后備母豬卵巢功能的潛在結合靶標,進一步進行機制驗證。

綜上所述,本研究結合活體試驗、多組學與網絡藥理學,從活體、代謝、轉錄和分子層面揭示了淫羊藿對后備母豬發情的影響和作用途徑,為淫羊藿治療后備母豬發情異常,提高后備母豬發情利用率提供理論依據。

4 結 論

本研究從活體、代謝、轉錄和分子層面揭示了淫羊藿對后備母豬發情的影響和作用途徑,發現飼喂淫羊藿能夠改變后備母豬卵巢轉錄與代謝模式,顯著提高血清FSH、LH和E2水平,進而促進母豬發情,淫羊藿的主要成分能夠與TP53、SRC、AKT1、CCND1、TNF、ESR1、EP300、ERBB2、JAK2、PARP1結合發揮調控作用。本研究為淫羊藿應用提高后備母豬發情利用率提供理論依據。