基于Hsp70基因的綿羊肺炎支原體TaqMan檢測方法的建立及其遺傳演化分析

江錦秀,張靖鵬,林裕勝,劉維巍,胡奇林,萬春和*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福州 350013;2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae, Movi)是引起山羊和綿羊發(fā)生羊支原體性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)的主要病原之一,現(xiàn)被認(rèn)為是一種分布在全球的家養(yǎng)綿羊和山羊的呼吸道病原體[1-3]。Movi宿主范圍異常廣泛,除山羊和綿羊外,在麝牛、馴鹿、大角羊等野生動(dòng)物中均檢測到該病原[4-6]。2001年以來,一些進(jìn)行定期監(jiān)測的國家報(bào)告了該病例,包括瑞典、美國、法國和英國[7-10]。其中在美國453個(gè)家養(yǎng)羊場中,88.0%的羊被檢測出Movi[7];在法國,2007—2019年Movi占小反芻動(dòng)物分離的所有支原體的16.4%[8],2005—2019年,在英格蘭和威爾士,Movi占小反芻動(dòng)物分離的所有支原體中的50.0%以上[10]。2012—2014年,對中國新疆6個(gè)地區(qū)羊Movi感染情況調(diào)查顯示,血清樣品的平均陽性率為17.8%,鼻拭子和肺組織樣品的平均陽性率分別為10.2%和28.9%[11]。然而,在更多的國家建立全球監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查之前,Movi感染的真正流行率還不得而知。

已有的研究報(bào)道顯示,分離自不同地域、不同宿主來源的Movi的基因存在高度多態(tài)性[12-13]。熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp70)也稱DnaK,在古細(xì)菌和植物到人類的所有生物體中均有發(fā)現(xiàn),是機(jī)體內(nèi)高度保守的生物分子,是生物細(xì)胞中含量最高的一種熱休克蛋白,也是Movi重要的膜結(jié)構(gòu)蛋白,具有免疫原性和免疫佐劑效應(yīng),其C-端抗原性優(yōu)勢明顯,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[14-16],是疫苗開發(fā)的潛在候選蛋白。Hsp70基因在支原體種內(nèi)保守,種間差異大[14-15],是分子生物學(xué)檢測的重要靶點(diǎn)。由于體內(nèi)Hsp70的變化與健康和患病狀況相關(guān),因此,它也可作為各種疾病的生理和病理狀況以及藥物靶標(biāo)的生物標(biāo)志物[17-19]。為了解Movi的流行情況及遺傳演化規(guī)律,本研究建立基于Hsp70基因的Movi TaqMan熒光定量PCR檢測方法,并對福建省Movi分離純化菌株的Hsp70基因進(jìn)行分析,以期為Movi 臨床診斷提供技術(shù)支撐,也為更進(jìn)一步了解Movi 遺傳演化規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣品

山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)F38株、山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumcapricolum,Mcc)、綿羊肺炎支原體(Movi)MO Y98標(biāo)準(zhǔn)株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰研究員惠贈(zèng);絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri, Mmc)、萊氏無膽甾原體(Acholeplasmalaidlawii, AL)、無乳支原體(Mycoplasmaagalactiae, Maga)、偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis, CP)、羊口瘡病毒(orfvirus,ORFV)、牛支原體(Mycoplasmabovis, Mb)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物病研究中心分離純化并保存。

88份有呼吸道癥狀的山羊鼻拭子樣品及解剖可見肺肝病變或胸膜肺炎癥狀的43份疑似MPSG的肺組織病料均來自福建省部分山羊養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

Probe qPCR Mix購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa);DL2000購自艾科瑞生物技術(shù)有限公司;DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒、2×TransStart?FastPfuFly PCR SuperMix (-dye)以及pEASY?-Blunt3 Cloning Kit試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;Biospin Gel and PCR Purification Kit購自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 TaqMan qPCR檢測方法的建立

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank上登錄的Movi strain 274菌株(登錄號(hào):CP079 199.1)的Hsp70基因保守序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7(v7.37)設(shè)計(jì)TaqMan qPCR的引物,Hsp70-qF1/R1和探針Hsp70-FAM以及MoviHsp70全基因分段擴(kuò)增引物Hsp70-F1/R1和Hsp70-F2/R2序列(表1),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 將Hsp70基因中位于921～1 400 bp 的序列片段(由生工生物工程股份有限公司合成)插入PUC57載體的N和A酶切位點(diǎn)之間,經(jīng)篩選后獲得含有Hsp70基因的質(zhì)粒(命名為Movi-Hsp70)為試驗(yàn)陽性標(biāo)準(zhǔn)品,利用微量核酸測定儀測定其濃度后,換算成拷貝數(shù),即5.72×107copies·μL-1),用EASY Dilution將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋。按照Probe qPCR Mix試劑盒說明書配制20 μL的TaqMan qPCR反應(yīng)體系,并對反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,以最高熒光值、最小的樣本閾值循環(huán)數(shù)(Cq值)確定建立的TaqMan qPCR方法的最佳反應(yīng)條件。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以Movi-Hsp70不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5.72×102～5.72×105copies·μL-1)為模板,利用優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應(yīng)條件,進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增反應(yīng),獲得擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo),以循環(huán)數(shù)閾值(Cq值)為縱坐標(biāo),繪制出建立的TaqMan qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 靈敏性試驗(yàn) 用優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應(yīng)條件,以不同質(zhì)粒濃度(5.72×102～5.72×10-1copies·μL-1)為模板,每個(gè)滴度進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn),同時(shí)設(shè)陰性對照,確定建立的TaqMan qPCR方法的最低檢測限。同時(shí),利用表1 中的引物(Hsp70-qF1/Hsp70-qR1),經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增,比較二者的敏感性。

1.3.5 特異性試驗(yàn) 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取牛羊常見病原菌(Maga、AL、Mmc、Mccp、Mcc、Mb、CP)基因組DNA,利用病毒DNA/RNA提取試劑盒對羊口瘡病毒(ORFV)提取基因組DNA。以提取的核酸DNA為模板,用優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應(yīng)條件,以質(zhì)粒濃度(5.72×103copies· μL-1)為陽性對照,對這些牛羊常見病原進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增反應(yīng),評價(jià)建立的TaqMan qPCR方法的特異性。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法的最佳反應(yīng)條件,以不同質(zhì)粒濃度(5.72×105、5.72×103、5.72×101copies·μL-1)為模板進(jìn)行檢測。每種標(biāo)準(zhǔn)品含量設(shè)置3個(gè)重復(fù),計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)(CV)。分別將上述標(biāo)準(zhǔn)品分裝后置于-20 ℃保存,每隔7 d取出,用優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法進(jìn)行檢測,共檢測3次,計(jì)算組間變異系數(shù)。

1.4 臨床樣品檢測

用本研究建立的Movi TaqMan qPCR方法及參考林裕勝等[20]建立的基于P113基因的TaqMan qPCR方法對福建省部分山羊場臨床送檢的88份羊鼻拭子樣品及43份疑似MPSG的肺組織病料進(jìn)行平行檢測,抽取10份檢測結(jié)果不符合的樣品用Hsp70-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序分析;另外,將檢測結(jié)果為Movi陽性的肺組織樣品進(jìn)行分離鑒定,將分離純化成功的菌株進(jìn)行Hsp70基因的擴(kuò)增、克隆和測序。

1.5 Hsp70基因擴(kuò)增與序列分析

1.5.1Hsp70基因分段擴(kuò)增及克隆測序 利用基因組DNA提取試劑盒提取Movi分離株DNA。使用設(shè)計(jì)的Hsp70基因分段擴(kuò)增引物(表1)進(jìn)行分段擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增50 μL體系:2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix 25 μL,模板5 μL,上、下游引物各1 μL(引物濃度均為10 μmol·L-1),ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 20 s,53 ℃ 20 s,72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將其與pEASY?-Blunt3 CloningVector載體連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)Trans1-T1;在SOC培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h,取適量菌液涂布含有X-Gal,IPTG和Amp的LB瓊脂平板,37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)過PCR驗(yàn)證為陽性的菌液送至福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。利用DNAStar7.0軟件中的SeqMan軟件對2個(gè)片段的序列進(jìn)行拼接得到完整的Hsp70基因序列。

1.5.2Hsp70序列及遺傳進(jìn)化分析 用DNAStar7.0軟件中的MegAlign軟件對從臨床病料中分離到的Movi菌株及18個(gè)Movi參考菌株進(jìn)行基因和氨基酸序列進(jìn)行分析。利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建Hsp70基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析Hsp70基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系。用NetNGlyc-1.0在線軟件預(yù)測N-糖基化位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 引物和探針分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中共檢索到24個(gè)Hsp70基因序列(21個(gè)山羊源Movi菌株和3個(gè)綿羊源Movi菌株)。對于正向引物Hsp70-qF1(5′-GTTCTTCTTGTTGGTGGATC-3′)(位于943～962 bp),24個(gè)Hsp70基因序列中有23個(gè)(95.8%)與設(shè)計(jì)的正向引物相匹配,只有1個(gè)(菌株J1,GenBank登錄號(hào)KC693 973.1)有不匹配的序列。對于反向引物Hsp70-qR1(5′-GCCACAACTTCATCAGGATTTATT-3′)(位于1 026～1 049 bp),24個(gè)Hsp70基因序列中有20個(gè)(83.30%)與設(shè)計(jì)的反向引物相匹配,只有4個(gè)(菌株FJ-36/L16/L17/Y98,GenBank登錄號(hào)OP121622/KC693 980.1/KC693 981.1/CP118 522.1)且僅在5′端第3位不匹配。對于探針Hsp70-FAM(5′-ACACGTATGCCAGCTGTTCAGACA-3′)(位置964～987 bp),則與24個(gè)Hsp70基因序列均100%匹配。引物Hsp70-qF1和Hsp70-qR1以及TaqMan探針Hsp70-FAM的變化見表2。

表2 綿羊肺炎支原體引物和探針序列變異分析Table 2 Sequence variation analysis of primers and probes of Movi

2.2 優(yōu)化后的TaqMan qPCR條件

優(yōu)化后的TaqMan qPCR方法最佳反應(yīng)體系(20 μL)如下:Probe qPCR Mix 10 μL,上、下游引物(濃度為10 μmol·L-1)各0.4 μL、探針(濃度為10 μmol·L-1)0.4 μL、模板2 μL、補(bǔ)充ddH2O至終體積20 μL。優(yōu)化出的TaqMan qPCR方法最佳反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

2.3 TaqMan qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以 Movi-Hsp70標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增,獲得擴(kuò)增曲線(圖1A)。以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板中拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo),以出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)閾值(Cq值)結(jié)果為縱坐標(biāo),獲得基于檢測Movi TaqMan qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1B)。結(jié)果顯示,建立的TaqMan qPCR方法在5.72×102～5.72×105copies·μL-1反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為1.00,擴(kuò)增效率為96.0%,斜率為-3.411,截距為37.29。結(jié)果表明建立的TaqMan qPCR方法線性關(guān)系良好、擴(kuò)增效率高。

1～4. 不同稀釋度的質(zhì)粒(5.72×102～5.72×105 copies·μL-1)1-4. Plasmids at different dilutions (5.72×102～5.72×105 copies·μL-1)圖1 TaqMan qPCR擴(kuò)增曲線(A)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.1 Amplification curve (A) and standard curve (B) of the TaqMan qPCR

2.4 TaqMan qPCR的特異性分析

采用所建方法對牛羊常見病原核酸樣品進(jìn)行檢測。從擴(kuò)增曲線可見,建立的TaqMan qPCR方法僅對Movi檢測出現(xiàn)陽性擴(kuò)增,對其他牛羊常見病原(Maga、AL、Mmc、Mccp、Mcc、Mb、CP和ORFV)均未見熒光信號(hào)(圖2)。

1. 綿羊肺炎支原體;2～9. 分別為無乳支原體、萊氏無膽甾原體、絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種、牛支原體、偽結(jié)核棒狀桿菌、羊口瘡病毒1. Movi; 2-9. Maga, AL, Mmc, MCCP, Mcc, Mb, CP, ORFV, respectively圖2 TaqMan qPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity analysis of TaqMan qPCR

2.5 TaqMan qPCR的靈敏性試驗(yàn)

用建立的TaqMan qPCR方法對不同濃度質(zhì)粒進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,5.72×102～5.72 copies·μL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均有特異性擴(kuò)增曲線,因此確定該方法對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測限為5.72 copies·μL-1(圖3),同時(shí),用常規(guī)PCR對以上相同濃度質(zhì)粒進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示常規(guī)PCR的最低檢測限為5.72×102copies·μL-1,即TaqMan qPCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍。

1～4. Movi-Hsp70質(zhì)粒濃度 5.72×102 至5.72×10-1 copies.μL-1;5. 陰性對照1-4. Movi-Hsp70 plasmid concentrations from 5.72×102 to 5.72×10-1 copies·μL-1; 5. Negative control圖3 TaqMan qPCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity analysis of TaqMan qPCR

2.6 TaqMan qPCR的重復(fù)性

將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn),結(jié)果顯示(表3),組內(nèi)變異系數(shù)為0.09%～0.84%,組間變異系數(shù)0.35%～0.45%,Cq值變異系數(shù)均在1.00%以內(nèi),表明本研究建立的TaqMan qPCR方法重復(fù)性好。

表3 TaqMan qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability analysis of the TaqMan qPCR

2.7 臨床樣品的檢測

臨床樣品的檢測結(jié)果見表4,基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測的臨床樣品陽性率高于基于P113基因的TaqMan qPCR方法;基于P113基因的TaqMan qPCR方法檢測的陰性樣品用基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測,結(jié)果也是陰性,符合率為100%。隨機(jī)抽取基于Hsp70基因的TaqMan qPCR方法檢測結(jié)果為陽性而基于P113基因的TaqMan qPCR方法檢測結(jié)果為陰性的10份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增(用Hsp70基因分段擴(kuò)增引物)后測序分析,測序結(jié)果顯示均為目的基因序列。將檢測結(jié)果為Movi陽性的40份肺組織樣品進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果分離到6株Movi,將分離純化成功的菌株進(jìn)行Hsp70基因的擴(kuò)增、克隆和測序。

表4 臨床樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of clinical samples

2.8 Hsp70基因的擴(kuò)增與序列分析

2.8.1Hsp70基因的擴(kuò)增 以提取的6個(gè)Movi菌株的DNA為模板,分別采用Hsp70基因引物分段擴(kuò)增基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定,結(jié)果顯示,出現(xiàn)與預(yù)期片段大小符合的條帶,隨后分別克隆后進(jìn)行測序。利用DNAStar7.0軟件中的SeqMan軟件對Hsp70基因2個(gè)片段的序列進(jìn)行拼接得到完整的Hsp70基因序列,結(jié)果顯示6個(gè)Movi菌株Hsp70基因大小均為1 818 bp。6個(gè)Movi分離菌株分別命名為FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41,將序列上傳至NCBI,獲得序列登錄號(hào)分別為OP121619～OP121624。

2.8.2Hsp70序列分析 利用DNAStar7.0軟件中的MegAlign軟件對Movi分離株FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41與各Movi參考菌株(均參考自NCBI)的Hsp70基因和氨基酸序列進(jìn)行分析。基因序列結(jié)果顯示,本試驗(yàn)獲取的6個(gè)Movi不同分離菌株之間核苷酸相似性在98.1%～100.0%,與山羊源菌株的親緣關(guān)系較近,核苷酸相似性在97.7%～99.4%,與綿羊源菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),核苷酸相似性在96.0%～96.7%;與綿羊源菌株相比,山羊源的Hsp70基因在1 777～1 779 bp處均插入3個(gè)核苷酸(TCA);FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41分離株與Movi Y98標(biāo)準(zhǔn)株相比分別有64、59、57、58、65個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),這些發(fā)生變異的位點(diǎn)無規(guī)則地分布在整個(gè)基因中。基于Hsp70基因構(gòu)建的進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,不同Movi菌株可以分成兩個(gè)大分支,分別為ClusterⅠ(宿主均為山羊)和ClusterⅡ(宿主均為綿羊),ClusterⅠ下有ClusterⅠA和ClusterⅠB兩個(gè)分支。FJ-28、FJ-29、FJ-32、FJ-36、FJ-38、FJ-41分離株的進(jìn)化樹分支均屬于ClusterⅠA(圖4),研究表明本試驗(yàn)分離的菌株與同樣來源于中國的山羊源菌株親緣關(guān)系更近,而與綿羊源菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.8.3 Hsp70氨基酸序列分析 氨基酸序列分析結(jié)果顯示,本試驗(yàn)獲取的6個(gè)Movi不同分離株之間氨基酸相似性在99.5%～100.0%,與山羊源的氨基酸相似性在99.2%～100.0%,與綿羊源的氨基酸相似性在98.0%～98.5%;與綿羊源菌株相比,所有山羊源分離株在25位(A→S)、89位(Q→D)、148位(E→A)、363位(E→D)、554位(L→V)均發(fā)生變異,且在593位點(diǎn)均插入Gln(谷氨酰胺)。Y98標(biāo)準(zhǔn)株、strain 150株與strain NXNK2203(均為綿羊源)在191、250、340、393、410、436位存在N末端糖基化位點(diǎn),其它山羊源菌株(除了J1株外)均在586位多了1個(gè)N末端糖基化位點(diǎn)(圖5)。

圖5 N末端糖基化位點(diǎn)分析Fig.5 Analysis of N-terminal glycosylation sites

3 討 論

目前檢測Movi最常用的方法為分子生物學(xué)檢測方法,包括常規(guī)PCR、qPCR、LAMP等方法。但是,LAMP方法假陽性較多;常規(guī)PCR敏感性不如qPCR,對于核酸含量低的樣品(如鼻拭子)可能存在漏檢。目前已有基于16S rRNA基因、EF-Tu基因建立的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法及基于P113基因建立的TaqMan qPCR檢測方法用于Movi流行病學(xué)調(diào)查[20-22]。Deshuillers等[23]報(bào)道稱,Movi分離株的基因組序列操縱子上存在2個(gè)重復(fù)的16S rRNA基因序列,這2個(gè)重復(fù)序列可能分別對應(yīng)不同的支原體屬或?yàn)閱我痪鷮俚闹貜?fù)序列,這提示16S rRNA 基因作為Movi系統(tǒng)鑒定靶標(biāo)的特異性并不夠強(qiáng)[24-26]。Zhang等[27]研究也表明,Hsp70基因比16S rRNA 基因更適合用于評估Movi與其它支原體的遺傳關(guān)系,可作為潛在的分子標(biāo)記。另有研究報(bào)道,基于Hsp70基因建立的常規(guī)PCR方法比基于16S rRNA 基因建立的常規(guī)PCR方法的靈敏度和特異性都有所提高[28-29]。

本研究基于Hsp70基因與基于P113基因的TaqMan qPCR檢測方法對樣品進(jìn)行平行檢測比較兩者符合率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于Hsp70基因的TaqMan qPCR檢測方法對臨床樣品(尤其是鼻拭子樣品)有更高的陽性率,可能的原因有兩個(gè)方面:一是Hsp70基因是高度保守的生物分子,本研究設(shè)計(jì)的引物及探針幾乎涵蓋了不同Movi 菌株Hsp70基因序列;二是Hsp70是在生物細(xì)胞中高效表達(dá)的一種熱休克蛋白。本研究中臨床鼻拭子樣品檢測結(jié)果的陽性率為52.27%,疑似MPSG的肺組織樣品檢測結(jié)果的陽性率為93.02%,如此高的陽性率主要是因?yàn)楦鶕?jù)本團(tuán)隊(duì)前期對福建省MPSG的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,福建省內(nèi)該病的主要流行病原為Movi,其次為Mmc[30]。

蛋白質(zhì)的 N-糖基化修飾是生物體調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾,其有重要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用。郭鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn),突變N-糖基化位點(diǎn)使熱休克蛋白gp96 的ATPase 活性、抗原交叉呈遞能力和免疫佐劑功能減弱,提示糖基化水平對熱休克蛋白gp96免疫功能產(chǎn)生直接影響。乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)的PrME蛋白和NS1蛋白的N-糖基化在免疫過程中起著重要的作用,一個(gè)N-糖基化消除的prME基因可以誘導(dǎo)較高的ELISA抗體、中和抗體和免疫保護(hù),但兩個(gè)N-糖基化都缺乏的基因則導(dǎo)致免疫力下降,在野生型和突變型NS1組中也觀察到類似的情況[33]。禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)HA蛋白上受體結(jié)合區(qū)域的糖基化修飾對受體結(jié)合特性有較大影響。H7N1病毒HA蛋白在150-loop的第158位新增一個(gè)糖基化修飾,形成空間干擾從而阻礙受體的結(jié)合,最終降低病毒對受體的親和力[34]。H5N6病毒HA蛋白第158位出現(xiàn)糖基化缺失后,不僅導(dǎo)致對人型受體的結(jié)合特異性增強(qiáng),而且增強(qiáng)了其在豚鼠中的致病性[35]。以上研究表明,N-糖基化位點(diǎn)的增加、缺失可能對蛋白的生物學(xué)活性及免疫特性產(chǎn)生影響。本研究中發(fā)現(xiàn)Movi山羊源分離株(除了J1)比綿羊源分離株均在586位多了1個(gè)N末端糖基化位點(diǎn),山羊源586位的糖基化位點(diǎn)對于Movi的感染、致病性及免疫應(yīng)答有無影響及其作用機(jī)制還需更進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性優(yōu)的基于Hsp70基因的Movi的qPCR檢測方法。序列分析發(fā)現(xiàn),不同來源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性較高,所有山羊源的菌株均比綿羊源菌株多了1個(gè)N-糖基化位點(diǎn);遺傳進(jìn)化分析證實(shí),Movi福建株與山羊源分離株遺傳關(guān)系較近(均處于山羊源ClusterⅠA亞分支)。本研究不僅為Movi 臨床診斷提供了檢測技術(shù)支撐,更為后續(xù)進(jìn)一步研究Movi 遺傳演化規(guī)律提供參考。