烏頭酸脫羧酶1對BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用研究

戴 帆,劉占有,張旭陽,李 武*

(1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室,銀川 750021;2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis,Mtb)感染引起的一種慢性呼吸道疾病[1-3]。盡管目前對TB的研究已經(jīng)很成熟,但是隨著耐多藥結(jié)核菌株(multidrug resistant strains of TB,MDR-TB)的出現(xiàn)、艾滋病共感染及新型冠狀病毒的大流行,使得TB的發(fā)病機(jī)制越發(fā)復(fù)雜多樣,一定程度上增加了TB的治療難度。Mtb是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,通過氣溶膠傳播感染宿主巨噬細(xì)胞,感染初期,Mtb通過釋放大量的細(xì)胞壁成分及代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡狀態(tài),宿主細(xì)胞通過增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞聚集來清除入侵的Mtb,與此同時Mtb也會通過抑制吞噬溶酶體融合、啟動自身休眠機(jī)制等來逃逸巨噬細(xì)胞清除[4-6]。

據(jù)報道,輕度炎癥反應(yīng)在識別病原微生物、抵御和清除病原體入侵等方面具有重要作用,病原體刺激巨噬細(xì)胞啟動代謝重編程,在巨噬細(xì)胞活化過程中會表達(dá)某些代謝酶[7]。三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)是細(xì)胞能量代謝的樞紐,有研究發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要功能,這對于研究一些疾病具有重要意義[8-10]。烏頭酸脫羧酶1(aconitate decarboxylase1,ACOD1),也稱免疫應(yīng)答基因(immune response genes 1,IRG1),ACOD1最初在 LPS(50 ng·mL-1)刺激的小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7細(xì)胞)中以2.3 ku的cDNA形式被發(fā)現(xiàn)[11]。因ACOD1含有糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)附著位點的一致序列,所以具有促進(jìn)炎癥部位白細(xì)胞浸潤、定位及分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)等作用,推測ACOD1可能具有免疫調(diào)節(jié)功能[12-14]。一方面ACOD1參與催化順烏頭酸脫羧生成衣康酸(itaconate)介導(dǎo)抗炎反應(yīng)[15-16]。另一方面金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)刺激會增加ACOD1的表達(dá),病原菌通過利用衣康酸來誘導(dǎo)自身生物膜的形成,促進(jìn)病原菌的生存[17-18]。因此認(rèn)為ACOD1在感染中發(fā)揮雙重作用,能引發(fā)不同的免疫反應(yīng)。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種模式識別受體,通過識別入侵細(xì)菌的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)來調(diào)控炎癥和其他的先天免疫反應(yīng)[19-20]。TLR4通路是炎癥反應(yīng)的典型代表,首先PAMPs和DAMPs激活TLR4,隨后通過招募髓系分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)介導(dǎo)IκB磷酸化來激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)調(diào)節(jié)先天性免疫,NF-κB激活后,通過移位到細(xì)胞核與DNA結(jié)合位點結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生重要的免疫介質(zhì),如促炎因子(TNF-α、IL-1β)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等參與炎癥反應(yīng)[19,21]。

在本試驗中,作者使用BCG誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生炎癥反應(yīng)。首先檢測BCG感染下ACOD1及TNF-α、IL-1β的表達(dá)變化,隨后基于小干擾RNA(si-ACOD1)技術(shù),構(gòu)建si-ACOD1結(jié)合BCG感染模型,進(jìn)一步檢測TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白(TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα)和細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、COX2、iNOS、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-α等)的變化情況,探討ACOD1對BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制,以期為TB的發(fā)生機(jī)制提供新研究思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與菌株來源

本試驗所用到的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所;BCG購自上海生物制品研究所。

1.2 試驗試劑

胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自Gibco公司;SDS電泳緩沖液、10×TG buffer緩沖液購自上海百賽生物技術(shù)有限公司;全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司;ACOD1抗體購自Abcam公司;β-actin抗體、羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體購自Abmart公司;其他所用抗體均來自Proteintech公司;HRP化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京原業(yè)伯樂生物發(fā)展科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑均購自ABclonal,引物由上海生物工程有限公司合成;ACOD1腺病毒干擾載體(siRNA-ACOD1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 細(xì)胞與菌株培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右傳代,選擇第三代以后對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

BCG接種在分枝桿菌即用型液體完全培養(yǎng)基中,于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6周,待BCG培養(yǎng)至OD600 nm=1.5后進(jìn)行傳代,其中以O(shè)D600 nm=0.1表示BCG的感染復(fù)數(shù)(MOI)為10,按照MOI=10的BCG感染巨噬細(xì)胞RAW264.7。

1.4 試驗分組設(shè)置

試驗BCG MOI處理組分為2組,即對照組(Control)和BCG MOI感染組,以感染時間為12 h感染巨噬細(xì)胞,其中MOI依次設(shè)置為5、10、15、20;BCG時間處理組分為2組,即對照組(Control)和BCG時間感染組,感染時間分別為6、12、18、24 h。

試驗分為4組,分別是對照組(Control)、BCG感染組(BCG)、ACOD1敲減組(si-ACOD1)和ACOD1敲減結(jié)合BCG感染組(si-ACOD1+BCG)。其中,Control組是不經(jīng)過任何處理的正常狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞;BCG組是細(xì)胞貼壁約80%左右,經(jīng)BCG處理12 h;si-ACOD1組和si-ACOD1+BCG組轉(zhuǎn)染siRNA-ACOD1,轉(zhuǎn)染24 h后si-ACOD1+BCG組使用BCG處理12 h。

1.5 小干擾RNA構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中查找鼠源ACOD1蛋白編碼序列,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成了三條干擾序列(表1),進(jìn)行干擾效率驗證。將生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞按1×106個接種于六孔板,待細(xì)胞融合度為60%左右做干擾處理,轉(zhuǎn)染試劑與小干擾RNA按照1∶1(10 μL∶10 μL)的比例轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染時間24 h。

表1 小干擾RNA序列Table 1 The sequence of small interfere RNA

1.6 qRT-PCR檢測

采用TRIZOL法提取總RNA,RNA濃度使用NanoDrop儀器(NanoDrop Technologies)測定,按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA原液。根據(jù)試驗所需進(jìn)行稀釋,之后進(jìn)行qRT-PCR分析。其中引物信息見表2,以β-actin作為熒光檢測PCR的內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理,使用 2-ΔΔCt方法計算mRNA 表達(dá)的相對倍數(shù)變化。

表2 qRT-PCR引物設(shè)計Table 2 Gene specific primers for qRT-PCR

1.7 全蛋白提取

使用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒對所提蛋白進(jìn)行蛋白濃度測定。隨后將蛋白依次進(jìn)行以下操作:SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉、搖床4 ℃過夜孵育兔抗鼠的一抗,如內(nèi)參蛋白β-actin和目的蛋白ACOD1、IL-1β、TNF-α,通路蛋白MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα以及鼠抗兔的TLR4一抗;隨后3% TBST洗膜5～6次,室溫孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)山羊抗免IgG和山羊抗鼠IgG二抗;3% TBST同樣洗膜5～6次;最后使用Amersham Image Quant 600儀器曝光處理,采用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.8 免疫熒光染色

在12孔板中每孔放入無菌的10 mm蓋玻片,隨后每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,以1×105個接種RAW264.7細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后按照試驗設(shè)計處理12孔板。首先棄掉12孔板中的培養(yǎng)基,使用無菌PBS緩慢沖洗3次,5 min·次-1;4%多聚甲醛常溫固定20 min;無菌PBS緩慢沖洗3次,5 min·次-1;0.5% TritonX-100通透15 min;無菌PBS緩慢沖洗3次,5 min·次-1;3% BSA常溫封閉1 h;4 ℃過夜孵育免抗鼠ACOD1抗體,每孔500 μL;第二天棄掉一抗,使用無菌PBS緩慢沖洗3次,5 min·次-1;加入山羊抗免IgG熒光二抗(用PBS稀釋,1∶500)500 μL避光孵育1 h;無菌PBS緩慢沖洗3次,5 min·次-1;準(zhǔn)備DAPI、載玻片、封片劑等封片處理,隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察表達(dá)情況。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7 內(nèi)ACOD1表達(dá)上調(diào)

為了探究BCG感染是否會引起ACOD1的表達(dá)變化,試驗通過Western blot和qRT-PCR方法檢測BCG在不同MOI下ACOD1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,與Control組相比,BCG感染會引起細(xì)胞內(nèi)ACOD1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)(圖1A～F);且在MOI=10、感染時間為12 h時,ACOD1表達(dá)極顯著(P<0.01)高于Control組。表明BCG可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)ACOD1高表達(dá)。

2.2 BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎性因子表達(dá)上調(diào)

前期研究表明炎癥反應(yīng)發(fā)生時細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào),而本試驗通過Western blot方法對BCG感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步驗證。結(jié)果顯示,BCG會以時間和濃度依賴性的方式上調(diào)IL-1β與TNF-α的表達(dá)(P<0.01)(圖2A～F)。表明BCG可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生炎癥反應(yīng)。

A. Western blot檢測BCG(MOI=10)感染不同時間后TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量;D.Western blot檢測BCG不同MOI下TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量;B～C、E～F.TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果。*. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001A. Western blot detection the expression of TNF-α and IL-1β protein levels of BCG infect in different time; D. Western blot detection the expression of TNF-α and IL-1β protein levels following BCG infection in different MOI; B-C, E-F. Bar graph analysis of the expression of TNF-α and IL-1β in mRNA and protein levels. *. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001圖2 BCG感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá)量Fig.2 The expression of relative proteins of inflammation by BCG-infected

2.3 小干擾ACOD1的篩選驗證

本試驗前期已經(jīng)證明BCG可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ACOD1高表達(dá)。為進(jìn)一步證明ACOD1在BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7中的具體作用,試驗設(shè)計合成了3條關(guān)于ACOD1的小干擾。通過熒光顯微鏡檢測其轉(zhuǎn)染效率(圖3A),采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測si-ACOD1轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞后的表達(dá)效果(圖3B～D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h轉(zhuǎn)染效率最佳,其中#2小干擾敲減效果最好(P<0.001),后續(xù)試驗均以#2 si-ACOD1進(jìn)行試驗。

A.熒光顯微鏡觀察siRNA-ACOD1轉(zhuǎn)染效率(100×),比例尺:100 μm;B.用三種不同靶向的siRNA-ACOD1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h后,Western blot檢測ACOD1蛋白的表達(dá)情況;C.ACOD1蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果;D. qRT-PCR檢測ACOD1 mRNA表達(dá)量。*. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001A. Immunofluorescence observation of ACOD1 protein expression level after knockdown (100×); B-D. RAW264.7 cells were transfected with three different targeting siRNA-ACOD1 for 24 h, and knockdown was verified by Western blot and qRT-PCR. *. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001圖3 ACOD1小干擾RNA的驗證Fig.3 Validation of interference efficiency of small interfering RNA targeting ACOD1

2.4 si-ACOD1下調(diào)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ACOD1的表達(dá)

試驗構(gòu)建ACOD1小干擾結(jié)合BCG感染模型,采用Western blot、qRT-PCR與免疫熒光技術(shù)驗證ACOD1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,與Control組相比,BCG感染組ACOD1表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.001);與BCG感染組相比,si-ACOD1+BCG 組ACOD1表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.001)(圖4A～C),免疫熒光試驗驗證了上述試驗結(jié)果(圖4D)。以上研究結(jié)果說明ACOD1干擾結(jié)合BCG感染細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

用siRNA-NC(陰性對照)或siRNA-ACOD1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h,然后用BCG感染12 h。A. Western blot檢測敲減結(jié)合BCG感染后ACOD1敲減效果;B.ACOD1蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果;C. qRT-PCR檢測ACOD1 mRNA表達(dá)量;D. 免疫熒光檢測敲減結(jié)合BCG感染后ACOD1敲減效果。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001RAW264.7 cells were transfected with siRNA-NC (Negative control) or siRNA-ACOD1 for 24 h and then infected with BCG for 12 h. A. Western blot was used to detect the knockdown effect of ACOD1 in combination with BCG infection; B. Grayscale analysis results of ACOD1 protein expression level; C. qRT-PCR was used to detect the expression level of ACOD1 mRNA; D. Immunofluorescence detection of knockdown combined with BCG infection in ACOD1 knockdown effect. *. P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001圖4 ACOD1敲減結(jié)合BCG感染巨噬細(xì)胞模型的建立Fig.4 ACOD1 knock-down combined with BCG infection

2.5 si-ACOD1參與BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)

試驗前期已經(jīng)證明BCG可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)發(fā)生,為進(jìn)一步驗證ACOD1在BCG引起的炎癥反應(yīng)中的具體作用,本試驗通過qRT-PCR技術(shù)驗證BCG感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,與Control組相比,BCG感染后促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2和iNOS的表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.001)(圖5A～E),IFN-α無顯著差異(圖5F),抑炎細(xì)胞因子IL-4表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.001)、IL-10表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.001)(圖5G～H),但是對于TGF-β無顯著差異(圖5I);與BCG感染組相比,si-ACOD1結(jié)合BCG感染組中促炎細(xì)胞因子極顯著下調(diào)(P<0.001),抑炎相關(guān)因子IL-4、IL-10極顯著上調(diào)(P<0.001),TGF-β無顯著差異;因此,結(jié)果提示BCG可以引起巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生,且ACOD1在炎癥反應(yīng)過程可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

(圖5續(xù) Continued)A～I(xiàn). qRT-PCR檢測BCG感染結(jié)合ACOD1敲減對炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的影響;J. Western blot檢測ACOD1敲減結(jié)合BCG感染后TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量;K～L. TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001A-I. Grayscale analysis the expression of cytokines was detected by qRT-PCR; J. Western blot detection the expression of TNF-α and IL-1β protein levels; K-L. Grayscale analysis of Western blot detection results of TNF-α and IL-1β protein. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001圖5 si-ACOD1結(jié)合BCG感染對細(xì)胞因子影響Fig.5 The expression of cytokines level by BCG infection in RAW264.7

2.6 si-ACOD1通過TLR4/ MyD88/NF-κB通路發(fā)揮作用

本研究通過Western blot試驗檢測BCG感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα的變化,驗證ACOD1對NF-κB信號通路的影響(圖6A)。結(jié)果表明:與Control組相比,BCG感染組TLR4、MyD88、p-IκBα、p-NF-κB p65表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01),TRAF6顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6A～F);與BCG感染組相比,si-ACOD1結(jié)合BCG感染組TLR4、MyD88、TRAF6表達(dá)極顯著下調(diào),p-NF-κB p65極顯著下調(diào),p-IκBα無顯著差異變化。綜上表明:ACOD1可以通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控BCG誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

A.Western blot檢測si-ACOD1結(jié)合BCG對TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)量情況;B～F.si-ACOD1結(jié)合BCG感染ACOD1蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001A. ACOD1 cells were transfected with siRNA-ACOD1 for 24 h, and then infected with BCG and cultured for 12 h. The expression of TLR4, MyD88, TRAF6, IκBα, p-IκBα, NF-κB p65, p-NF-κB p65 were detected by Western blot; B-F. Grayscale analysis of Western blot detection results. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001圖6 si-ACOD1結(jié)合BCG感染對信號通路的影響Fig.6 Effect of ACOD1 knockdown on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway induced by BCG infection

3 討 論

巨噬細(xì)胞是宿主啟動免疫防御的第一道防線,炎癥感染初期,巨噬細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮吞噬、抗原遞呈等作用,細(xì)胞因子和趨化因子會招募其他免疫細(xì)胞至炎癥部位進(jìn)一步清除病原菌[13,22]。ACOD1被認(rèn)為是病原菌刺激下高度上調(diào)的基因之一,在抵御病原微生物入侵中發(fā)揮重要作用[23]。作者的研究發(fā)現(xiàn),BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生炎癥反應(yīng),并上調(diào)ACOD1表達(dá)。

多項研究表明,ACOD1敲除的小鼠存活率普遍較差,細(xì)菌負(fù)荷與病毒易感性增加,中性粒細(xì)胞產(chǎn)生失衡,組織損傷嚴(yán)重并伴有細(xì)胞因子風(fēng)暴,說明ACOD1對機(jī)體有免疫保護(hù)作用[24-25]。但是也有研究發(fā)現(xiàn),利什曼原蟲(Leishmania)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)等感染細(xì)胞或組織,ACOD1表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子及ROS的表達(dá),下調(diào)抑炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá),病原菌通過利用ACOD1誘導(dǎo)產(chǎn)生的衣康酸來誘導(dǎo)自身生物膜形成,幫助自身生存以及加重組織細(xì)胞肺損傷[17,26-28];此外,ACOD1對內(nèi)毒素耐藥巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的免疫抑制作用可能導(dǎo)致免疫麻痹和危及生命的繼發(fā)感染[12]。綜上表明,ACOD1在感染中起到雙重作用,引發(fā)不同的免疫反應(yīng)[29]。ACOD1異常表達(dá)與機(jī)體炎癥、抗菌過程等密切相關(guān),為此ACOD1通路變化將會影響機(jī)體免疫相關(guān)信號的表達(dá)以及各種疾病的發(fā)生[11]。作者通過小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建了si-ACOD1結(jié)合BCG感染模型,選用Western blot、qRT-PCR、免疫熒光等技術(shù)檢測BCG感染后細(xì)胞因子的表達(dá)情況,結(jié)果表明,si-ACOD1結(jié)合BCG感染可以下調(diào)由BCG感染引起的促炎因子的表達(dá),上調(diào)抑炎因子IL-4、IL-10的表達(dá),作者還研究了INF-α與TGF-β的作用,同時si-ACOD1可以下調(diào)由BCG感染引起的COX2與iNOS表達(dá),說明ACOD1可以促進(jìn)由BCG感染引起的RAW264.7細(xì)胞炎癥。但是ACOD1究竟是如何參與到BCG感染引起的炎癥反應(yīng)中的,其具體機(jī)制尚未完全研究清楚。與作者發(fā)現(xiàn)相反的是,Mtb感染小鼠及骨髓巨噬細(xì)胞同樣可以誘導(dǎo)ACOD1表達(dá),但ACOD1是通過激活衣康酸或者誘導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)因子A20的產(chǎn)生來抑制TLR觸發(fā)的NF-κB通路激活,進(jìn)而抑制細(xì)胞因子及ROS產(chǎn)生,緩解炎癥反應(yīng)[25,30]。

有研究表明:ACOD1上調(diào)與TLR的激活有關(guān),該信號通路調(diào)節(jié)廣泛的炎癥反應(yīng)[19]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族參與病原體感染、組織損傷和腫瘤炎癥,靜息狀態(tài)下,p50與p65會以二聚體形式存在細(xì)胞質(zhì)中;NF-κB被激活后,磷酸化修飾的IKKα/γ降解IκB亞基,活化p65等轉(zhuǎn)錄激活因子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,促進(jìn)IL-6、IL-8、IL-12、GM-CSF、M-CSF等的合成及釋放[22,31-32]。在本研究中,ACOD1通過激活TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白活化表達(dá)來上調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá),敲減ACOD1可以下調(diào)由BCG感染引起的TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)。此外有研究發(fā)現(xiàn),LPS刺激巨噬細(xì)胞,ACOD1通過抑制p65和IRF3的活化來抑制TLR4觸發(fā)的促炎細(xì)胞因子和IFN-β產(chǎn)生[15]。這與作者的研究相反,作者的研究表明ACOD1在BCG感染引起的炎癥中起到正向調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究得出以下結(jié)論,BCG感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中ACOD1發(fā)生高表達(dá),敲減ACOD1可以抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,這種抑制可能通過TLR4/ MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮作用,研究清楚ACOD1在BCG感染中發(fā)揮的作用,可能為研究Mtb的發(fā)病機(jī)制提供一種新的思路,對遏制結(jié)核分枝桿菌的傳播具有十分重要的意義。