腎素血管緊張素系統(tǒng)在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸-血屏障損傷中的調(diào)控作用

張崇昊,馬 暢,2,李志強(qiáng),伍 鋼,張?jiān)词?

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095;2.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)療保障中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室,南京 210002)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種典型的結(jié)腸炎癥性疾病,表現(xiàn)為血性腹瀉、全身感染等癥狀,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡,嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的身體健康[1]。腸道菌群失調(diào)、腸道屏障損傷和免疫反應(yīng)異常被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎的重要致病機(jī)制[2]。最近,腸血管屏障的存在被Spadoni等[3]證明,腸血管屏障損傷在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用也越來越受到重視。有研究提出,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGFA)的異常表達(dá)可能是潰瘍性結(jié)腸炎血管屏障損傷的重要原因[4]。VEGFA不僅是最有效的促血管生成因子,而且可以促進(jìn)質(zhì)膜膜泡關(guān)聯(lián)蛋白(plasmalemma vesicle associated protein, PLVAP)表達(dá),誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞開口,以及誘導(dǎo)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin protein, VE-cadheirn)內(nèi)化,破壞黏附連接進(jìn)而引起血管通透性升高[5-7]。多項(xiàng)研究已證實(shí):血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)誘導(dǎo)同樣促進(jìn)了PLVAP的表達(dá),并且能夠靶向VE-cadherin而引起血管通透性升高[8-9]。另一項(xiàng)研究進(jìn)一步指出血管緊張素Ⅱ受體-1(Ang Ⅱ receptor type 1, AT1R)拮抗劑可以抑制VEGFA誘導(dǎo)的血管通透性升高[10]。提示AngⅡ參與了血管屏障的調(diào)控。

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system, RAS)由經(jīng)典通路(classic renin angiotensin system, cRAS) 和調(diào)節(jié)通路(regulatory renin angiotensin system, rRAS)兩條通路組成。cRAS通路包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-coverting enzyme, ACE)、Ang Ⅱ和AT1R。rRAS通路包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-coverting enzyme, ACE2)、血管緊張素1-7(angiotensin1-7, Ang1-7)和Mas受體(Mas receptor, MasR)[11]。在生理狀態(tài)下,ACE2/Ang1-7/MasR與ACE/Ang Ⅱ/AT1R通路相互拮抗,維持血壓正常和電解質(zhì)平衡,從而維護(hù)機(jī)體穩(wěn)態(tài)[12]。而在病理狀態(tài)下,經(jīng)典通路中的關(guān)鍵酶ACE異常活化,水解血管緊張素Ⅰ(angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)產(chǎn)生大量Ang Ⅱ,進(jìn)而與AT1R結(jié)合促進(jìn)組織或細(xì)胞炎性損傷、細(xì)胞凋亡、纖維化和氧化應(yīng)激等[13-14]。ACE2是調(diào)節(jié)通路的主要酶,可以水解Ang Ⅱ生成Ang1-7,后者與MasR結(jié)合發(fā)揮拮抗ACE/Ang Ⅱ/AT1R通路的作用[15]。ACE2通過水解Ang Ⅱ 在多種炎性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用,這已在非酒精性脂肪肝病、腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種組織或細(xì)胞損傷中得到證實(shí)[16-18]。鑒于ACE2在體內(nèi)存在的廣泛性,作為新的靶點(diǎn),其抗炎、抗損傷作用一直是研究熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)擬用DSS構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型,明確小鼠結(jié)腸局部ACE2和ACE等RAS主要成分在結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中的變化,及結(jié)腸炎期間血管損傷和與血管病變相關(guān)的重要因子VEGFA等的表達(dá)變化,并通過分析ACE2和ACE表達(dá)與血管屏障關(guān)鍵因子VEGFA的相關(guān)性,探討腸道局部RAS在DSS致小鼠結(jié)腸炎及腸血管屏障損傷中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡雄性健康SPF級(jí)ICR小鼠,購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(蘇)2017-0027。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中。自由采食,小鼠常規(guī)飼料由該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物試驗(yàn)符合南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)相關(guān)要求(GB/T 35892—2018)。

1.2 試劑

葡聚糖硫酸鈉鹽(Dextran sulfate sodium, DSS, MW: 36～50 ku)、糞便隱血試劑盒均購自南京凱默爾生物科技中心;無水乙醚購自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)材料供應(yīng)中心;4%多聚甲醛通用型組織固定液購自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司等。

小鼠VEGFA ELISA試劑盒購自南京南京建成生物工程研究所;小鼠Ang Ⅱ 和Ang1-7 ELISA試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司等。雙色預(yù)染蛋白Marker購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜購自美國Millipore公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司等。

兔源ACE2抗體(anti-ACE2)、ACE抗體(anti-ACE)、β-微管蛋白抗體(anti-β-tubulin)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗[Goat anti-Rabbit IgG (H+L) HRP]均購自南京巴傲得生物科技有限公司;兔源質(zhì)膜膜泡關(guān)聯(lián)蛋白抗體(anti-PLVAP)購自江蘇親科生物研究中心有限公司等。

1.3 儀器

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);LWD200-37 T倒置顯微鏡(上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司);Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司,瑞士);POWER-PAC300電泳儀(Bio-Rad公司,美國);POWER-PAC HC轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad公司,美國);Tanon-3900全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海Tanon科技有限公司)等。

1.4 動(dòng)物分組與處理

1.4.1 適應(yīng)性喂養(yǎng)和分組處理 將16只小鼠隨機(jī)分為4籠,自由采食常規(guī)飼料,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按體重相近原則分為正常對(duì)照組(Control組)和葡聚糖硫酸鈉鹽處理組(DSS組)。Control組小鼠從第1天開始每天灌胃0.1 mL生理鹽水,持續(xù)至第8天,試驗(yàn)全程飲用無添加劑飲用水。DSS組小鼠從第1天開始每天灌胃0.1 mL生理鹽水,持續(xù)至第8天,從第4天開始在飲用水中添加DSS(終濃度為4%),每天更新DSS飲用水,持續(xù)至第12天,模型構(gòu)建方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)參考顧思臻等[19]方法。處理流程如圖1所示。

圖1 小鼠結(jié)腸炎模型構(gòu)建流程圖Fig.1 Flowchart of establishment of mouse colitis model

1.4.2 臨床癥狀觀察和DAI評(píng)分 試驗(yàn)過程中,每天觀察小鼠精神狀況、被毛、飲食和肛門出血狀況,并拍照記錄肛門出血。試驗(yàn)第4天飲用DSS之前稱量所有小鼠體重,記為第0天體重,之后每天更換DSS飲用水前稱量小鼠體重,記為第m天體重(m=0～8)。

參照Alex等[20]方法從試驗(yàn)第4天飲用DSS之前計(jì)算小鼠疾病活躍指數(shù)(disease activity index, DAI),記為第0天DAI,之后每天更換DSS飲用水前計(jì)算小鼠DAI。DAI計(jì)算公式:DAI=體重下降率評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+糞便隱血評(píng)分,DAI計(jì)算相關(guān)參數(shù)具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 DAI計(jì)算相關(guān)參數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 DAI calculation related parameters scoring standard

1.5 樣品采集

1.5.1 血液樣本采集 DSS處理8 d后,禁食12 h。吸入乙醚麻醉小鼠,用1 mL一次性注射于左胸心搏動(dòng)最強(qiáng)處進(jìn)針,緩慢回抽進(jìn)行心采血。2 500 r·min-115 min。吸取血清至凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 結(jié)腸樣本采集 心采血結(jié)束后,處死小鼠,打開小鼠腹腔,完整分離結(jié)腸,測(cè)量回盲口至肛門腸道長度并拍照記錄。分離小鼠結(jié)腸,于距離肛門約1 cm截取部分無糞便結(jié)腸組織置4%多聚甲醛中固定,剩余組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

固定組織送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織切片的制作及HE染色。顯微鏡下觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué),包括結(jié)腸上皮完整性、炎性細(xì)胞浸潤、黏膜下層水腫狀況和肌層厚度等變化。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

1.7.1 血液VEGFA含量的ELISA檢測(cè) 按照VEGFA試劑盒說明書進(jìn)行。以空白孔調(diào)零,450 nm波長下測(cè)量各孔樣品吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)孔濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算血清中VEGFA含量(單位:ng·L-1)。

1.7.2 結(jié)腸組織中Ang Ⅱ和Ang1-7含量的ELISA檢測(cè) 稱取30 mg結(jié)腸組織,加入含有終濃度為1 mmol·L-1PMSF的預(yù)冷PBS中充分勻漿。12 000 r·min-1離心15 min,取上清液備用。

根據(jù)Ang Ⅱ和Ang1-7檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。以空白孔調(diào)零,450 nm波長下測(cè)量各孔樣品吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)孔濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各孔樣品中Ang Ⅱ和Ang1-7含量。

1.8 結(jié)腸組織中ACE2、ACE和PLVAP蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

樣品制備:分別稱取約30 mg各小鼠結(jié)腸組織,加入PMSF的預(yù)冷RIPA裂解液中充分勻漿。冰浴超聲5 min,4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min,取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度,統(tǒng)一稀釋至4 μg·μL-1。加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃水浴,使蛋白質(zhì)徹底變性。

SDS-PAGE:濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%。每孔上樣量為10 μL。以濃縮膠80 V 30 min,分離膠120 V 60 min的條件進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

轉(zhuǎn)印和封閉:將電泳分離后的蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,轉(zhuǎn)印條件為100V冰浴90 min。依據(jù)蛋白Marker,將PVDF膜按照目的蛋白分子量裁剪成不同條帶。將條帶放入裝有5%封閉液的孵育盒中,置于搖床上室溫封閉2 h。

抗體孵育:TBST洗滌蛋白條帶3次,將anti-β-tubulin 按1∶10 000,anti-ACE2按1∶3 000,anti-ACE和anti-PLVAP按1∶1 000比例用TBST稀釋,與蛋白條帶在4 ℃下孵育過夜。TBST洗滌,將辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗按1∶10 000比例稀釋,與蛋白條帶室溫孵育2 h。

蛋白顯影與定量:TBST洗滌條帶3次,與ECL發(fā)光液避光孵育1 min,使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。用Image J軟件檢測(cè)目的蛋白條帶灰度值,以β-tubulin灰度值為標(biāo)準(zhǔn),ACE2、ACE和PLVAP灰度值與其相比得到相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 DSS誘導(dǎo)建立小鼠結(jié)腸炎模型

2.1.1 小鼠臨床表現(xiàn)和體重變化 臨床表現(xiàn):試驗(yàn)過程中,對(duì)照組小鼠正常飲食,精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,被毛有光澤。DSS組小鼠食欲減弱,精神沉郁,對(duì)外界刺激反應(yīng)不敏感,被毛雜亂。

體重變化結(jié)果由表2看出,與對(duì)照組相比,DSS組小鼠平均體重變化率低于對(duì)照組,且隨著處理時(shí)間的變化而持續(xù)下降,并在處理的第8天表現(xiàn)為顯著下降(P<0.05 )。

表2 小鼠體重變化率Table 2 The change of body weight rate of mice %

2.1.2 疾病活躍指數(shù)和結(jié)腸長度變化 DAI結(jié)果見表3。由表3看出,DSS組小鼠DAI極顯著升高 (P<0.01)。結(jié)腸長度測(cè)定結(jié)果見圖2所示,DSS組小鼠結(jié)腸長度極顯著短于正常對(duì)照組(P<0.01)。

表3 小鼠疾病活躍指數(shù)和結(jié)腸長度變化Table 3 The change of DAI and colonic length of mice

**. P<0.01圖2 小鼠結(jié)腸長度變化Fig.2 Colonic length change of mice

2.1.3 小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)結(jié)果 結(jié)果見圖3。HE染色顯示對(duì)照組小鼠黏膜層(mu)、黏膜下層(sm)和肌層(m)排列正常,黏膜層頂端吸收柱狀細(xì)胞排列整齊(arrow),可見大量杯狀細(xì)胞(g),固有層較薄(LP),含少量淋巴細(xì)胞。基底部隱窩豐富(circle),排列整齊,含大量杯狀細(xì)胞(g),黏膜肌層正常(mm)。DSS處理組黏膜層頂端柱狀上皮細(xì)胞排列混亂,杯狀細(xì)胞稀少(g),固有層炎性細(xì)胞浸潤(IC)。隱窩減少(circle),隱窩內(nèi)杯狀細(xì)胞減少,黏膜肌層肌纖維分離(mm)。

A～C. 對(duì)照組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)(A.內(nèi)層排列正常;mu.黏膜;sm.黏膜下層;m.肌層;B黏膜層放大,箭頭.柱狀吸收細(xì)胞;g.杯狀細(xì)胞;LP.固有層;C. 結(jié)腸黏膜底部放大,mm. 黏膜肌層;circle. 隱窩);D～F. DSS組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)(D. 內(nèi)襯結(jié)構(gòu)混亂,mu.黏膜;sm.黏膜下層;m.肌層;E. 結(jié)腸黏膜放大;g.杯狀細(xì)胞;LP.固有層;F. 結(jié)腸黏膜底部增大;mm. 黏膜肌層;circle. 隱窩)A-C. Colonic structure of mice in Control group (A. Normal arrangement of the lining layers; mu. Mucosa; sm. Submucosa; m. Musculosa; B. Enlargement of colonic mucosa; arrow. Absorptive columnar cells; g. Goblet cells; LP. Lamina propria; C. Enlargement of the base of the colonic mucosa, mm. Muscularis mucosa; circle. Crypts); D-F. Colonic structure of mice in DSS group (D. Confusing structure of the lining layer; mu. Mucosa; sm. Submucosa; m. Musculosa; E. Enlargement of colonic mucosa; g. Goblet cells; LP. Lamina propria; F. Enlargement of the base of the colonic mucosa, mm. Muscularis mucosa; circle. Crypts)圖3 小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)HE染色Fig.3 HE staining of colonic structure in mice

結(jié)合以上小鼠一般狀況、體重變化、DAI、結(jié)腸長度及病理組織學(xué)變化結(jié)果表明,本試驗(yàn)連續(xù)給小鼠飲用4% DSS 8 d后會(huì)誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎,即試驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒ⅰ?/p>

2.2 結(jié)腸炎小鼠血管屏障的損傷結(jié)果

如圖4所示,與對(duì)照組相比,DSS組小鼠伴有腸血管損傷,表現(xiàn)為肛門明顯出血(圖4A)。ELISA檢測(cè)顯示,小鼠結(jié)腸組織中血管通透性重要致病因子VEGFA含量極顯著升高(P<0.01,圖4B)。Western blot檢測(cè)顯示血管內(nèi)皮通透性升高標(biāo)志蛋白PLVAP表達(dá)極顯著升高(P<0.01,圖4C)。提示:DSS致小鼠結(jié)腸炎時(shí),腸血管屏障處于損傷狀態(tài)。

A. 小鼠便血圖片;B. 血液中VEGFA的含量;C. PLVAP在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)。**. P<0.01A. The pictures of hematochezia in mice; B. The content of VEGFA in blood; C. Expression of PLVAP in colonic tissue of mice. **. P<0.01圖4 小鼠腸道血管屏障的變化Fig.4 Changes of gut-vascular barrier in mice

2.3 結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Ang1-7和Ang Ⅱ含量的變化

結(jié)果如表4所示。與正常對(duì)照組相比,DSS組小鼠結(jié)腸組織中Ang1-7含量顯著升高(P<0.05),Ang Ⅱ 含量極顯著升高(P<0.01),Ang Ⅱ含量的升高更加明顯,是Ang1-7的2.8倍。即Ang Ⅱ 處于更高水平狀態(tài)。

表4 小鼠結(jié)腸組織中Ang1-7和Ang Ⅱ的含量Table 4 The content of Ang1-7 and Ang Ⅱ in colonic tissue of mice ng·L-1

2.4 結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ACE2和ACE的表達(dá)變化

結(jié)果如圖5所示。與正常對(duì)照組相比,DSS組小鼠結(jié)腸組織中ACE2 (P<0.01,圖5A)、ACE(P<0.01,圖5B)的表達(dá)均極顯著上調(diào)。ACE/ACE2比值極顯著升高 (P<0.01,圖5C)。提示DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后,ACE表達(dá)占優(yōu)勢(shì)。

A. Western blot檢測(cè)ACE與ACE2表達(dá);B、C. ACE、ACE2表達(dá)的灰度值;D. ACE與ACE2表達(dá)比值。**. P<0.01A. Western blot detection of ACE and ACE2 expression; B, C. The grayscale values of ACE and ACE2 expression; D. Ratio of ACE to ACE2 expression. **. P<0.01圖5 小鼠結(jié)腸ACE2和ACE表達(dá)變化Fig.5 Effects of DSS treatment on the expression of ACE2 and ACE in mouse colon

2.5 小鼠結(jié)腸組織中蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

結(jié)果如圖6所示,DSS處理后,ACE2和ACE的表達(dá)變化和PLVAP表達(dá)變化呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別是0.830和0.896;Ang1-7、Ang Ⅱ含量變化與VEGFA含量變化呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.926和0.941。相關(guān)性大小ACE/PLVAP和Ang Ⅱ/VEGFA大于ACE2/PLVAP和Ang1-7/VEGFA。

熱圖方格中數(shù)字大小反應(yīng)兩蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性大小,數(shù)字越大,說明相關(guān)性越大,反之越小The size of the number in the heat map box reflects the correlation between the expression of the two proteins. The larger the number, the greater the correlation, and vice versa圖6 小鼠結(jié)腸組織中ACE2、ACE和PLVAP表達(dá)變化及Ang1-7、Ang Ⅱ和VEGFA表達(dá)變化的相關(guān)性熱圖Fig.6 The relationship between the expression of ACE2, ACE and PLVAP and the expression of Ang1-7, Ang Ⅱ and VEGFA in the colon of mice

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病,通常引起患者血性腹瀉、體重減輕,嚴(yán)重者誘發(fā)全身感染,并造成死亡[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)在腸系膜淋巴結(jié)和與之聯(lián)系的脾中存在腸道病原體,但在門靜脈和與之聯(lián)系的肝中鮮少發(fā)現(xiàn)[3]。提示存在一種特定的血管機(jī)制防止病原進(jìn)入血液。結(jié)合潰瘍性結(jié)腸炎過程中血管被描述不規(guī)則、滲漏,表明腸血管損傷可能是一種重要的致病機(jī)制。VEGFA是一種血管通透因子[23]。有研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中,上皮屏障損傷及其介導(dǎo)的病原入侵激活結(jié)腸上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等,進(jìn)而引起VEGFA大量釋放并促進(jìn)PLVAP的表達(dá)。PLVAP是一種血管通透性的調(diào)節(jié)器,然而其在具有屏障作用的內(nèi)皮細(xì)胞中的大量表達(dá)被認(rèn)為是病理性的[6]。VEGFA對(duì)血管通透性的上調(diào)可能是造成結(jié)腸炎血管損傷的機(jī)制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,DSS處理造成了小鼠體重減輕、疾病活躍指數(shù)升高、結(jié)腸縮短以及結(jié)腸組織學(xué)損傷,表明建立的小鼠結(jié)腸炎模型成立。同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠肛門出血,結(jié)腸PLVAP表達(dá)升高,血管性結(jié)腸炎致病因子VEGFA釋放也升高,表明小鼠腸道血管通透性升高。

前期研究發(fā)現(xiàn),潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織ACE、ACE2的基因表達(dá)無變化,但在炎性區(qū)域ACE2活性顯著下降,并且Ang1-7和MasR的染色強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組,同時(shí),該研究還顯示結(jié)腸的纖維化程度與ACE/Ang Ⅱ/AT1R 經(jīng)典通路呈正相關(guān),而與ACE2活性呈負(fù)相關(guān)[24]。另有研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中,結(jié)腸黏膜ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR的表達(dá)均上調(diào)[25-27]。而外源性輸注Ang Ⅱ能夠加重結(jié)腸炎癥過程中的組織學(xué)損傷,使用ACE抑制劑、阻礙Ang Ⅱ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或敲除AT1R均能下調(diào)黏附分子的表達(dá),抑制炎性細(xì)胞趨化和促炎因子釋放[28-30]。盡管對(duì)于結(jié)腸炎中研究結(jié)果存在差異,但一些趨勢(shì)仍表明ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR在結(jié)腸炎中存在相互拮抗,后者具有一定的抵抗或保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),DSS處理引起結(jié)腸ACE2和ACE表達(dá)均上調(diào),Ang1-7和Ang Ⅱ含量升高,即在小鼠結(jié)腸炎時(shí),小鼠結(jié)腸黏膜ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR的表達(dá)均上調(diào)。

Ang Ⅱ誘導(dǎo)能促進(jìn)PLVAP的表達(dá),并且能夠靶向VE-cadherin而引起血管通透性升高。同時(shí),AT1R拮抗劑可以抑制VEGFA誘導(dǎo)的血管通透性升高。這提示Ang Ⅱ參與了血管屏障的調(diào)控。作者通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ACE2、ACE、Ang1-7、Ang Ⅱ表達(dá)上調(diào)與PLVAP和VEGFA的表達(dá)升高存在相關(guān)性,并且與ACE2/Ang1-7表達(dá)上調(diào)相比,ACE/AngⅡ表達(dá)上調(diào)與PLVAP以及VEGFA升高相關(guān)性更密切,提示結(jié)腸炎時(shí)Ang Ⅱ可能與PLVAP協(xié)同參與了腸-血屏障損傷的發(fā)生發(fā)展。鑒于在多種疾病中ACE2/Ang1-7/MasR通過抵抗ACE/Ang Ⅱ/AT1R而發(fā)揮抗炎癥、抗損傷等保護(hù)作用[31],推測(cè):結(jié)腸炎過程中ACE/Ang Ⅱ的激活導(dǎo)致Ang Ⅱ的過量產(chǎn)生,ACE2的表達(dá)上調(diào)可能是用于降解過度產(chǎn)生的Ang Ⅱ,以抵抗高水平的Ang Ⅱ。但結(jié)腸炎過程中ACE產(chǎn)生Ang Ⅱ的作用大于ACE2的降解能力,高水平的Ang Ⅱ加劇了腸-血屏障的損傷。結(jié)果提示:通過激活A(yù)CE2或增強(qiáng)對(duì)Ang Ⅱ的降解,可能是治療或緩解潰瘍性結(jié)腸炎的新的思路。

4 結(jié) 論

本研究通過4% DSS建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,小鼠結(jié)腸表現(xiàn)出血管屏障受損,局部RAS處于激活狀態(tài),ACE/Ang Ⅱ通路的激活占優(yōu)勢(shì),Ang Ⅱ參與了結(jié)腸炎小鼠腸-血屏障的損傷過程。研究結(jié)果提示通過激活A(yù)CE2或過表達(dá)ACE2,增強(qiáng)其對(duì)Ang Ⅱ的降解作用以緩解腸-血屏障的損傷,可能是治療或緩解潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)新的思路或途徑。