分子動力學模擬結合相溶解度研究非諾貝特與甲基-β-環糊精的包合行為

邢雨霖,沈文康,王佳瑜,洪偉銘,張金基,艾鳳偉*

(1.徐州醫科大學 藥學院,江蘇 徐州 221004;2.江蘇恩華藥業股份有限公司藥物研究院 江蘇省中樞神經藥物研究重點實驗室,江蘇 徐州 221000)

FNB是1975年首次上市的一個抗高脂血癥藥物,具有降低血液中膽固醇、甘油三酯、低密度和極低密度脂的作用,主要用于治療高膽固醇血癥、嚴重高甘油三酯血癥和血脂異常[1]。然而,FNB屬于生物制藥分類系統(BCS)Ⅱ類化合物中典型的低溶解度藥物,由于高親脂性幾乎完全不溶于水(logP=5.243),導致其通過上皮膜滲透性低而影響生物利用度[2-3]。因此,提高FNB的溶解度是擴展其治療應用的關鍵。

提高低水溶性藥物的生物利用度是當前制藥行業面臨的一個重要挑戰,據統計,大約90%的新化學實體由于低溶解度而影響了臨床應用[4]。一直以來,多種制劑技術和制劑手段被研究應用于提高難溶性藥物的溶解度,如固體分散體、納米制劑技術、微粉化和環糊精包合等,其中,環糊精具有提高藥物溶解度、增強藥物穩定性、降低刺激性等優良的藥劑學特性,引起研究人員的極大關注[5]。環糊精是葡萄糖單體通過α-1,4糖苷鍵連接的錐形環狀分子,具有親水的外表面和疏水內空腔[6],常見的α,β和γ-環糊精由6,7,8個葡萄糖分子構成,直徑分別為0.47,0.60 和 0.75 nm,不同直徑的環糊精對裝載的藥物分子有特定的選擇性。RMβCD是β-環糊精C2、C3、C8的羥基部分被甲基取代,具有更高的水溶性,在水中溶解度可以達到50%以上,生物體內相容性好,是理想的藥物增溶載體材料[7-8]。

隨著計算機技術和量子化學的發展,利用計算機模擬環糊精包合物的研究能更好地了解主客體分子的結合方式,在分子水平上探討受體與客體分子相互作用以及結合過程的動態變化。目前,環糊精包合物文獻的研究模式多是通過相溶解度法考察環糊精對藥物的增溶作用,制備環糊精包合物并進行結構表征,環糊精包合機理和制備表征相結合方面的研究相對較少,因此,本研究采用相溶解度實驗和分子模擬相結合的方法研究RMβCD和FNB的包合過程,探索FNB和RMβCD分子間的相互作用和包合機理,此研究方法有望為其他難溶性藥物分子篩選環糊精載體材料提供一定的理論指導。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

SHA-B水浴振蕩器(上海力辰儀器科技有限公司);ATY-124電子天平(島津分析儀器有限公司);KQ-200KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-3100 pc紫外可見分光度計(上海美普達儀器有限公司)。

FNB(上海麥克林生化科技有限公司,含量99%);RMβCD(平均取代度=12,山東濱州智源生物科技有限公司);0.45 μm微孔過濾器(天津津騰);無水乙醇、溴化鉀(國藥集團化學試劑有限公司),純凈水。

1.2 方法

1.2.1 FNB紫外含量測定方法的建立

稱取適量FNB,RMβCD分別配制成一定濃度溶液進行紫外全波長掃描,結果顯示FNB在290 nm處有最大吸收,而RMβCD在290 nm處無明顯紫外吸收,對FNB最大吸收無干擾,選擇290 nm作為FNB紫外含量測定檢測波長。

精密稱取FNB 0.007 5 g,無水乙醇溶解定容于50 mL的量瓶中,精密移取上述FNB溶液10 mL置于100 mL量瓶中30%乙醇定容,得15 μg·mL-1的FNB儲備液,分別移取1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,30%乙醇溶液定容,在波長290 nm處測定吸光度。以吸光度(A)對濃度(C)作圖, 得標準曲線方程為A=0.052 2C+0.029 9,R2=0.999 9。在1.5～15 μg·mL-1質量濃度范圍內線性關系良好,方法學考察精密度、穩定性和回收率實驗均符合要求。

1.2.2 相溶解度實驗

配制0,2,4,6,8,10 mmol/L的RMβCD溶液10 mL于量瓶中,依次加入過量的FNB,置于恒溫水浴振蕩器在25,35,45 ℃條件下以100 r·min-1的轉速振搖24 h使FNB和RMβCD充分結合,所得樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液1.1 mL加入無水乙醇2 mL,30%的乙醇溶液適當稀釋,紫外290 nm處測定吸光度,平行操作三次。根據標準曲線方程計算FNB濃度,以RMβCD濃度為橫坐標,FNB濃度為縱坐標繪制相溶解度曲線,由公式(1) 計算不同溫度下的包合穩定常數(KS),其中,S0為RMβCD濃度等于0時 FNB的溶解度,slope為相溶解度曲線的斜率。

KS=slope/[S0(1-slope)]

(1)

1.2.3 分子對接

β-CD(編號:762697)和FNB(編號:214632)的三維結構均來自劍橋晶體結構數據庫(https://ccdc.cam.ac.uk/),RMβCD的結構是基于β-CD結構使用Avogadro軟件進行繪制獲得,RMβCD結構作為對接過程的受體,FNB作為配體,將配體FNB和受體RMβCD利用AutoDockTools-1.5.7進行去水和加全氫等預處理,使用 AutoDock-Vina進行半柔性分子對接[9],以整個RMβCD結構作為潛在的結合位點進行盲對接。對接坐標為x=21.0,y=15.0,z=15.0,選擇自由結合能最低的構象使用 Pymol進行結果分析。

1.2.4 分子動力學模擬

2 結果與討論

2.1 相溶解度

不同溫度下的FNB-RMβCD相溶解度曲線如圖1所示,可見FNB濃度隨RMβCD濃度增加而增大,25,35,45 ℃下的相溶解度曲線方程分別為y=0.006 4x-0.006 2,y=0.009 2x-0.008 9和y=0.009 2x-0.008 9,曲線斜率小于1,根據Higuchi and Connors相溶解度曲線分類屬于AL型,即 RMβCD與FNB按照物質的量比 1∶1形成包合物。三個溫度下的包合穩定常數KS分別為4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,說明隨著溫度的升高包合穩定常數增大,越有利于包合物的生成,這可能與溫度升高可以增加主客體分子在溶液中的無序分布,進而增加分子間接觸機會從而有利于包合物的生成。

圖1 FNB和RMβCD的相解度圖

2.2 分子對接

(a)大口端正視圖;(b)小口端正視圖。

2.3 結構穩定性與結合構象

分子動力學模擬可驗證分子對接結果的可靠性和形成包合物的動力學穩定性[13],均方根偏差(RMSD)是一種用于描述結構偏差的標準測量,有助于分析生物結構的時間依賴性運動,RMSD值的變化反映了模擬過程中受體與配體分子之間相互作用姿態的改變,RMSD在一定范圍波動達到收斂時,可以認為分子的構型變化較小,結構達到穩定[14-15]。

圖3為200 ns的模擬時間內包合物中主客體分子和包合物相對初始結構的RMSD動態變化圖。圖3(a)和(b)分別為FNB和RMβCD的RMSD圖,在分子動力學模擬中FNB和RMβCD的RMSD均值分別為(0.193 3±0.040 2) nm和(0.146 8±0.028 8) nm,說明主客體分子結構的變化均在非常小的范圍內,而包合物圖3(c)的RMSD在0～20 ns的模擬時間內有一個從初始的0.15 nm增加到0.30 nm的變化,結合圖3(d)不同模擬時間的包合物結合構象可知在0 ns時,FNB的芳香環已完全進入RMβCD疏水性空腔內, 15 ns時與甲酯基連接的芳香環已部分脫離RMβCD空腔,在后續150 ns的模擬時間里主要維持這樣的結合構象,這可能是由于環糊精小口端的甲基基團與FNB分子的空間位阻所致,此外,RMβCD包合物在～25,～60,～90,～130 ns和顯示出更大的偏離收斂軌跡的現象,這些偏差表明包合物的多種不同穩定構象可能是FNB分子在RMβCD結構空腔內的重新取向。整個200 ns模擬中包合物的RMSD均值為(0.291 9±0.077 1) nm,可能是由于FNB和RMβCD形成了更大空間結構的包合物結構體,而且FNB分子在RMβCD在空腔中的位置和結構動態變化對兩者的構象有一定程度的影響,所以包合物的RMSD較自由的FNB和RMβCD單體都有增加。然而,FNB-RMβCD包合物和主、客體分子RMSD波動幅度都在較小的范圍內,說明模擬過程中結構已達穩定狀態。

(a)FNB;(b)RMβCD;(c)FNB-RMβCD;(d)不同時間的結合構象。

2.4 FNB-RMβCD結合能自由能分析

模擬體系結合自由能的變化直接反映了主客體分子間相互作用的大小[16]。FNB和RMβCD之間的相互作用自由能通過分子力學泊松-玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)將熵貢獻、構象波動與MD模擬數據相結合計算。根據RMSD分析結果選擇結構完全穩定的180～200 ns時間的模擬數據進行結合自由能分析,結果如圖4所示。

(a)結合自由能;(b)組成圖。

FNB和RMβCD的結合自由能(圖4a)為(-12.76 ±1.84) kcal/mol,結合自由能為負值說明包合過程為非外力驅動的自發過程,結合自由能數值越小,結合力越強,在180～200 ns的模擬時間內的結合自由能呈規律性的小范圍波動,說明模擬結合構象達到穩定狀態;MM-PBSA將結合自由能拆分成分子力學項(GGAS)和溶劑化能(GSOLV),其中GGAS包括范德華能量項(VDWAALS)和靜電能量項 (EEL),而GSOLV又分為極性溶劑化能(EPB)和非極性溶劑化能(ENPOLAR)。圖4b所示為FNB和RMβCD的結合自由能組成,GGAS是結合自由能的主要貢獻者,反映出主客體分子間強烈的相互作用,GGAS中范德華力起到關鍵的作用,靜電力作用相對較小,而GSOLV對結合自由能呈負面作用,說明溶劑化不利于主客體分子的結合。

3 結論

首先,在 25,35,45 ℃的相溶解度實驗中,FNB 的溶解度隨RMβCD濃度的增加而呈線性的增大,不同溫度下相溶解度曲線均為 AL型,斜率小于1,表明FNB與RMβCD按1∶1的物質的量比形成包合物,三個溫度下的包合穩定常數分別為4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,提示隨著溫度的升高有利于包合物的形成,可能升高溫度增加了FNB和RMβCD分子的無序運動而促使包合物的生成。