通竅定眩飲調節糖酵解改善腦缺血大鼠血管新生的機制研究

張藝 左麗婉 張啟 伍昌總 劉春華

本文引用： 張? 藝， 左麗婉， 張? 啟， 伍昌總， 劉春華. 通竅定眩飲調節糖酵解改善腦缺血大鼠血管新生的機制研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 531-537.

〔摘要〕 目的 探究通竅定眩飲對腦缺血后血管新生的分子機制，并基于糖酵解通路探討其可能的作用機制。方法 共40只大鼠，隨機選取6只為假手術組，余采用大鼠大腦中動脈阻塞法建立腦缺血模型。24只造模成功的大鼠用隨機分為模型組、丁苯酞組、聯合用藥組、通竅定眩飲組，每組6只。假手術組、模型組予蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，丁苯酞組予丁苯酞54 mg/（kg·d）灌胃，聯合用藥組予丁苯酞54 mg/（kg·d）和中藥藥液14.6 g/（kg·d）灌胃，通竅定眩飲組予中藥藥液14.6 g/（kg·d）灌胃。干預3 d后采用Zea-Longa法觀察大鼠的神經功能評分;TTC染色法確定腦損傷范圍;ELISA法檢測乳酸、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和葡萄糖含量，免疫組化法檢測葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）蛋白的表達以及微血管密度變化。結果 與假手術相比，模型組有明顯神經功能缺損，腦梗死體積比明顯增加（P<0.05），乳酸含量增加（P<0.05），ATP和葡萄糖含量減少（P<0.05），GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達增加（P<0.05），微血管密度增加（P<0.05）。與模型組相比，丁苯酞組神經功能缺損程度及腦梗死體積比明顯降低（P<0.05），乳酸、ATP和葡萄糖含量無顯著變化（P>0.05），GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達無顯著變化（P>0.05），微血管密度增加（P<0.05）;聯合用藥組和通竅定眩飲組神經功能缺損程度及腦梗死體積比明顯降低（P<0.05），乳酸、ATP和葡萄糖含量均增加（P<0.05），GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達及微血管密度顯著增加（P<0.05）。與聯合用藥組相比，丁苯酞組腦梗死體積比增加（P<0.05），乳酸、ATP和葡萄糖含量減少（P<0.05），GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達降低（P<0.05），微血管密度降低（P<0.05）;通竅定眩飲組腦梗死體積比增加（P<0.05），乳酸、ATP和葡萄糖含量無顯著變化（P>0.05），GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達無顯著變化（P>0.05），微血管密度降低（P<0.05）。結論 通竅定眩飲對腦缺血模型具有一定的神經保護作用，其機制可能與調控糖酵解通路促進血管新生有關。

〔關鍵詞〕 通竅定眩飲;糖酵解;腦缺血;血管新生;葡萄糖轉運蛋白1;己糖激酶2;乳酸脫氫酶A

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.001

Mechanism of Tongqiao Dingxuan Decoction regulating glycolysis to improve angiogenesis in rats with cerebral ischemia

ZHANG Yi， ZUO Liwan， ZHANG Qi， WU Changzong， LIU Chunhua*

The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Abstract〕 Objective To explore the molecular mechanism of Tongqiao Dingxuan Decoction （TQDXD） on cerebral ischemia-induced angiogenesis， and to discuss its possible mechanism of action based on the glycolysis pathways. Methods A total of 40 rats were used， six rats were randomly selected as sham-operated group， and the rest were used to establish a cerebral ischemia model by the method of middle cerebral artery occlusion. Twenty-four rats with successful modeling were randomized into model， butylphthalide， combination， and TQDXD groups， with six rats in each group. Sham-operated and model groups were treated with distilled water 10 mL/（kg·d）， butylphthalide group with butylphthalide 54 mg/（kg·d）， combination group with butylphthalide 54 mg/（kg·d） and TQDXD 14.6 g/（kg·d）， and TQDXD group with TQDXD 14.6 g/（kg·d）. All the drugs and distilled water were administered by gavage. After 3 d of intervention， the neurological function of the rats was scored using the Zea-Longa method; the extent of cerebral infarction was determined by TTC staining; the levels of lactate， adenosine triphosphate （ATP）， and glucose were measured by ELISA; the protein expressions of glucose transporter 1 （GLUT1）， hexokinase 2 （HK2）， and lactate dehydrogenase A （LDHA）， as well as changes in microvessel density were examined by immunohistochemistry. Results Compared with the sham-operated group， the model group exhibited significant neurological deficits and obviously increased volume ratio of cerebral infarction （P<0.05）， elevated lactate level （P<0.05）， decreased ATP and glucose levels （P<0.05）， higher protein expressions of GLUT1， HK2， and LDHA （P<0.05）， and increased microvessel density （P<0.05）. Compared with the model group， the butylphthalide group showed significantly reduced neurological deficits and volume ratio of cerebral infarction （P<0.05）， and increased microvessel density （P<0.05）， with no significant changes in lactate， ATP， and glucose levels （P>0.05）， nor in the protein expressions of GLUT1， HK2， and LDHA （P>0.05）; both the combination and TQDXD groups showed significantly reduced neurological deficits and volume ratio of cerebral infarction （P<0.05）. increased lactate， TP， and glucose levels （P<0.05）， and si gnificantly elevated protein expressions of GLUT1， HK2， and LDHA， and microvessel density （P<0.05）. Compared with the combination group， the butylphthalide group exhibited increased cerebral infarction area （P<0.05）， decreased lactate， ATP， and glucose levels （P<0.05）， lower protein expressions of GLUT1， HK2， and LDHA （P<0.05）， and reduced microvessel density （P<0.05）; the TQDXD group showed increased cerebral infarction area （P<0.05） and decreased microvessel density （P<0.05）， with no significant changes in the levels of lactate， ATP， and glucose （P>0.05）， nor in the protein expressions of GLUT1， HK2， and LDHA （P>0.05）. Conclusion TQDXD has a certain neuroprotective effect on cerebral ischemia model， and its mechanism may be related to regulating glycolysis pathways to promote angiogenesis.

〔Keywords〕 Tongqiao Dingxuan Decoction; glycolysis; cerebral ischemia; angiogenesis; glucose transporter 1; hexokinase 2; lactate dehydrogenase A

中風是全世界致殘和死亡的第二大原因，缺血性中風（ischemic stroke，IS）占其中87%，其高發病率和高致殘率造成極高的醫療負擔[1]。IS急性期治療的主要目的是迅速重建缺血區血液供應，盡可能挽救受損的腦細胞，減輕缺血缺氧對腦組織造成的不可逆性損傷。目前，溶栓和血管內介入治療（包括血管內機械取栓、動脈溶栓、血管成形術）是臨床上常用的方法[2]，然而，有限的治療時間窗以及嚴格的適應證和禁忌證等因素可能導致溶栓治療的延遲[3]。IS后腦血容量的增加與血管新生有關，通過促進缺血半暗帶區血管新生，對恢復局部血液供應和重建受損神經元功能等方面起到重要作用[4]。而血管內皮細胞依賴糖酵解產生能量：在生理條件下，血管內皮細胞中85%以上的ATP由糖酵解產生[5]。當發生缺氧時，神經元和血管內皮細胞的糖酵解過程加速，以暫時維持細胞的正常能量供應[6]。此外，糖酵解過程中產生的乳酸還可以抑制免疫監視，刺激內皮細胞形成新的血管[7]。因此，維持適度的糖酵解有助于促進血管新生。前期研究[8-10]發現，通竅定眩飲可降低患者血黏度、改善動脈供血、促進血管新生、恢復腦缺血神經功能。而目前尚未明確通竅定眩飲是否能通過調節糖酵解和促進血管新生保護神經元。在本研究中，我們擬在進一步證實通竅定眩飲對大鼠的神經保護作用的基礎上，重點觀察通竅定眩飲對大鼠的神經保護作用是否與促進糖酵解反應有關。

1 材料

1.1? 實驗動物

健康雄性SD大鼠，體質量250～280 g，共40只，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（動物編號：430727231101448513），購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心[許可證號：SYXK（湘）2019-0009]。室溫20～25 ℃，濕度50%～70%，自由進食、飲水，適應性喂養1周，術前12 h禁食不禁水。實驗通過湖南中醫藥大學實驗委員會審查批準（編號：LL2023060702）。

1.2? 藥物

通竅定眩飲（黃芪30 g、熟地黃15 g、制何首烏10 g、葛根45 g、紅花10 g、赤芍10 g、地龍10 g、桃仁10 g、天麻10 g、石菖蒲10 g、川芎6 g）飲片購自湖南中醫藥大學第二附屬醫院。通竅定眩飲生藥量為166 g，設成人標準體質量為70 kg，大鼠/成人換算系數為6.18[11]，制成濃度為14.6 g/（kg·d）（等同于成人常規量）的中藥藥液，冷藏備用。將丁苯酞軟膠囊（石藥集團恩必普藥業有限公司，國字準號：H20050299，規格：0.1 g*24粒，批號：1182303114）內的藥物倒出，每劑加入60 mL純水，制成劑量濃度為54 mg/（kg·d）的西藥藥液。

1.3? 主要試劑及儀器

GLUT1抗體、HK2抗體、LDHA抗體、血小板內皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）抗體、ATP含量測定試劑盒、乳酸含量試劑盒、葡萄糖含量測定試劑盒（湖南艾方生物科技有限公司，批號分別為AF03468、AF04602、AF10640、SAF005、ADS-W-A001-96、ADS-W-T009-96、AF1023）。1% TTC染色液（上海畢得醫藥科技股份有限公司，批號：01G230149）;4%多聚甲醛（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：01J230124）;恒溫箱（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）;包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）;脫水機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ-12J）;組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-P）。

2 方法

2.1? 模型制備

采用大腦中動脈線栓法制作腦缺血模型[9]，將大鼠麻醉后固定，利用常規眼科剪從頸部正中切開，暴露并游離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎翼顎動脈，避免線栓插入翼鄂動脈，頸外動脈殘端用眼科剪剪開一“V”型小口，插入尼龍線栓直至大腦中動脈的起始處，遇輕微阻力后停止進線，線栓插入（17.5±0.5） mm，結扎消毒后逐層縫合皮下組織和皮膚。假手術組大鼠麻醉成功后，仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總動脈及頸內、外動脈后縫合切口。術后參考Zea-Longa 5分法評分，得分0表示沒有明顯的神經癥狀，得分1表示無法完全伸展左前肢，得分2表示旋轉到左側，得分3表示走路時向左傾倒，而得分4則表示無法有意識地獨自行走。得分越高則表明神經功能缺損越嚴重，其中分值1～3分（無法完全伸展左前肢、旋轉到左側、走路時向左傾倒）認為造模成功。

2.2? 動物分組

造模前選擇6只大鼠作為假手術組，造模成功后，取24只造模成功大鼠按照隨機數字表法隨機分為模型組、丁苯酞組、聯合用藥組、通竅定眩飲組，每組6 只。

2.3? 藥物干預

造模后第1天開始，丁苯酞組予西藥藥液10 mL/（kg·d）;通竅定眩飲組予中藥藥液10 mL/（kg·d）;聯合用藥組予西藥藥液10 mL/（kg·d）聯合中藥藥液10 mL/（kg·d）;假手術組、模型組予等量蒸餾水10 mL/（kg·d）。分別予相應藥物干預3 d后取材。

2.4? 觀察指標

2.4.1? 神經功能學評分? 在第3天用單盲法對各組大鼠進行Zea-Longa 5分法評分。

2.4.2? TTC染色法檢測腦梗死體積? 取腦后，切除大腦半球以外組織，用TTC染液染色。觀察染色結果可見正常腦組織染成紅色，缺血區呈灰白色。用4%多聚甲醛進行固定，24 h后采集圖片，并用ImagePro Plus 6.0軟件分析每片腦組織的梗死面積、腦片總面積。每只大鼠腦梗死體積比=（腦片梗死總面積/腦片總面積）×100%。

2.4.3? ELISA法測定ATP、乳酸、葡萄糖含量? 按照試劑盒說明書進行標準品制備，稱取約0.1 g腦組織加入研缽中，加入1 mL提取液，進行冰浴勻漿，12 000 r/min（離心半徑10 cm），4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測，酶標儀預熱30 min以上，調節波長至450 nm，混勻，立即于37 ℃條件下避光反應30 min，于450 nm處讀取吸光值A，ΔA=A測定-A對照。讀取OD值。繪制標準曲線，分別計算ATP（μmol/g）、乳酸（μmol/g）、葡萄糖（mmol/L）含量，通過與假手術組含量對比得出相對值。

2.4.4? 免疫組化法測定腦組織中糖酵解相關蛋白GLUT1、HK2、LDHA表達? 取包埋后的腦組織切片，過氧化氫浸泡，濕盒中進行一抗孵育，加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色結果，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，將切片置于光學顯微鏡下觀察，采用Scan Scope數字病理掃描系統計數陽性細胞數，其中陽性細胞數為棕黃色顆粒或胞質染成黃色。用ImagePro Plus 6.0軟件進行分析相關蛋白表達的平均光密度值。

2.4.5? 免疫組化法測定微血管密度? 使用PANNORAMIC全景切片掃描儀將組織切片上機，采用CaseViewer 2.4掃描軟件選取組織的目的區域進行200倍成像，成像完成后使用ImagePro Plus 6.0分析軟件，選取切片中大腦皮層缺血區的3個視野，對CD31標記的微血管斷面數目進行計數，并計算3個視野血管數的平均值，即微血管密度值（個/視野）。

2.5? 統計學方法

采用Graphpad Prism 9.0統計作圖軟件進行分析。計量資料以“x±s”表示，符合正態性分布，組間比較采用方差分析。若方差齊，則采用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較;若方差不齊，則采用Welch檢驗，Dunnett's T3法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 通竅定眩飲對神經功能評分的影響

假手術組大鼠Zea-Longa評分結果為0分，神經功能表現正常。與假手術組比較，模型組、聯合用藥組及通竅定眩飲組大鼠的Zea-Longa評分差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，3 d丁苯酞組、聯合用藥組和通竅定眩飲組的Zea-Longa評分較模型組下降，差異有統計學意義（P<0.05）;與同組0 d相比，差異有統計學意義（P<0.05）。詳見圖1。

3.2? 通竅定眩飲對大鼠腦梗死體積的影響

腦缺血3 d，梗死腦組織TTC染色結果顯示，模型組大鼠具有明顯的梗死組織，提示造模成功。與模型組比較，丁苯酞組、聯合用藥組和通竅定眩飲組腦梗死組織均顯著減小（P<0.05）;與聯合用藥組比較，丁苯酞組和通竅定眩飲組大鼠腦梗死體積比增加（P<0.05）。詳見圖2、圖3。

3.3? 通竅定眩飲對乳酸、ATP、葡萄糖的影響

與假手術組相比，模型組大鼠皮層乳酸含量顯著升高（P<0.05），ATP和葡萄糖含量顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，聯合用藥組和通竅定眩飲組大鼠皮層乳酸含量、ATP和葡萄糖含量增加（P<0.05）。與聯合用藥組相比，丁苯酞組乳酸、ATP和葡萄糖含量減少（P<0.05）;通竅定眩飲組乳酸、ATP和葡萄糖含量無顯著變化。詳見圖4。

3.4? 通竅定眩飲對GLUT1、LDHA、HK2蛋白的影響

與假手術組比較，在藥物干預第3天，模型組大鼠皮層GLUT1、HK2、LDHA蛋白表達水平升高（P<0.05）;與模型組比較，丁苯酞組GLUT1、HK2、LDHA蛋白表達水平無顯著變化（P>0.05），聯合用藥組與通竅定眩飲組大鼠皮層GLUT1、HK2、LDHA蛋白表達水平升高（P<0.05）。與聯合用藥組相比，丁苯酞組GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達降低（P<0.05）;通竅定眩飲組GLUT1、HK2、LDHA蛋白的表達無顯著變化（P<0.05）。詳見圖5、圖6。

3.5? 通竅定眩飲對微血管密度的影響

與假手術組比較，在藥物干預后第3天，模型組大鼠皮層微血管密度增加（P<0.05）;與模型組比較，丁苯酞組、聯合用藥組和通竅定眩飲組皮層微血管密度顯著增加（P<0.05）;與聯合用藥組比較，丁苯酞組和通竅定眩飲組皮層微血管密度降低（P<0.05）。詳見圖7、圖8。

4 討論

缺血性腦卒中歸屬于中醫學“缺血性中風”范疇，以“虛、火、風、痰、氣、血”為總病機，王清任在《醫林改錯·半身不遂本源》中指出：“夫元氣藏于氣管之內，分布周身，左右各得其半……無氣則不能功，不能動。”指出元氣不足，不能濡養周身致半身不遂，“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，氣為血帥，氣虛血行不暢，久停則為瘀，提出因虛致瘀的觀點，并以此創制補陽還五湯治療氣虛血瘀所致的IS。劉春華教授認為，本病以脾腎虧虛為內因，痰瘀為發病之宿根，將IS病機總結為“氣精虧虛、痰瘀阻絡”，并立“益氣填精、活血化痰”為基本治法;方中以黃芪、熟地黃、制何首烏為君，黃芪健脾補氣，令氣旺血行，痰濁無以內生，血行瘀去則經絡暢通，熟地黃、制首烏補益肝腎之陰精以平肝陽并充養腦髓;以葛根、紅花、赤芍、地龍、桃仁為臣，葛根升發清陽以養腦竅，紅花、當歸補血活血，赤芍、桃仁活血化瘀以通腦絡;天麻、石菖蒲為佐，天麻性味甘平，善化痰平肝，石菖蒲性味辛溫，可開竅豁痰、醒神益智;川芎為血中之氣藥，活血行氣通絡，善上行頭目而為使。諸藥合用，共奏益氣填精、活血化痰之功，以達腦絡暢通，神機復用之效。前期研究表明，通竅定眩飲在缺血性腦卒中后通過抑制凋亡、促進神經元的修復[8]和促進血管新生[12]等途徑發揮抗腦缺血的作用。本研究結果發現，模型組大鼠神經功能評分、腦梗死體積比明顯增加，經通竅定眩飲干預后，大鼠的神經功能評分、腦梗死體積比明顯降低，大鼠腦組織微血管密度有所增加，提示通竅定眩飲通過調節血管新生對模型大鼠發揮神經保護作用，該結果與前期研究[9]相吻合。

越來越多的證據表明，在腦缺血后，腦組織能夠通過能量代謝的重編程和抗氧化防御來增強其代謝可塑性[13]。代謝重編程是生物體內適應不同的生理條件或環境壓力，代謝途徑和代謝活動重新調整或改變的過程。而糖酵解是維持細胞在低氧環境下生存的重要代謝途徑，有助于細胞在缺氧環境中繼續正常運作[14]。有研究表明，糖酵解是維持血管內皮細胞增殖、遷移及血管形成的關鍵調節劑[15]。在缺氧情況下，神經元及血管內皮細胞糖酵解加速，維持細胞的正常能量供應[16]。然而隨著缺血缺氧的進一步加重，代謝重編程被過度激活，糖酵解加速并產生過量的乳酸，可能導致繼發性腦損傷[17]。腦缺血后腦組織可能適應性反應增強腦組織中的葡萄糖攝取緩解腦缺血損傷，腦組織中GLUT-1的表達增加[18]。在葡萄糖酵解途徑的起始階段，在病理狀態下HK2被誘導將細胞內攝取的葡萄糖磷酸化，并增加細胞的葡萄糖利用率[19]，最終LDHA催化丙酮酸轉化為乳酸，并在此過程中釋放能量，在短時間內為細胞提供ATP。本研究中，模型組大鼠糖酵解相關蛋白表達增加，乳酸增加，ATP、葡萄糖含量減少，提示在缺氧環境下，腦組織通過糖酵解途徑供能;而經通竅定眩飲干預后，糖酵解相關蛋白表達進一步增加，ATP、乳酸、葡萄糖含量均升高，提示通竅定眩飲可能通過促進糖酵解進程，激發血管新生，從而減少腦梗死面積，在腦缺血前期，為腦細胞供氧供能提供保障。動物實驗研究表明，丁苯酞可以通過多種分子機制促進血管新生和發揮神經保護作用[20-21]，本實驗中，聯合用藥能有效增加微血管密度、減少腦梗死面積，為中西醫結合治療腦缺血提供有力證據。

綜上所述，本研究初步證明通竅定眩飲可能通過上調糖酵解相關蛋白和促進微血管增生的方式，減少模型大鼠的腦梗死面積和改善神經功能評分。這一研究為通竅定眩飲在腦缺血治療中的應用提供了可靠的科學依據。由于研究時限，未能長時間觀察糖酵解相關蛋白表達及代謝產物，未來，我們將進一步研究通竅定眩飲治療腦梗死的量效關系及給藥時長對糖酵解的影響，深入探究糖酵解對腦梗死發展的影響機制，為臨床治療提供新的研究方向。

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〔基金項目〕湖南省教育廳科研項目（22A0269）;湖南省研究生科研創新項目（CX20220818）。

〔通信作者〕*劉春華，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：liuchunhua@hnucm.edu.cn。