血必凈注射液對LPS誘導的急性肺損傷大鼠炎癥反應及細胞凋亡的影響

賴桂花 譚金曲 李萌萌 付成效 曾亞華 王婷 王娟 廖念 周君 屈萌艱

本文引用： 賴桂花， 譚金曲， 李萌萌， 付成效， 曾亞華， 王? 婷， 王? 娟， 廖? 念， 周? 君， 屈萌艱. 血必凈注射液對LPS誘導的急性肺損傷大鼠炎癥反應及細胞凋亡的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 538-544.

〔摘要〕 目的 觀察血必凈注射液對脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的急性肺損傷大鼠炎癥反應及細胞凋亡的影響。方法 將30只雄性SD大鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（20只），造模組造模后（尾靜脈注射LPS）隨機分為模型組（10只）和血必凈注射液組（10只）。采用肺組織濕重/干重評估肺組織水腫程度，ELISA檢測血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18的水平，HE染色觀察大鼠肺組織病理損傷情況，TUNEL染色觀察肺組織細胞凋亡情況，RT-PCR和Western blot檢測凋亡因子胱天蛋白酶-3（Caspase-3）和胱天蛋白酶-8（Caspase-8）的mRNA含量和蛋白水平。結果 與正常組比，模型組大鼠肺組織濕重/干重升高（P<0.01），IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18升高（P<0.001），肺組織出現損傷和炎癥浸潤，細胞凋亡率升高（P<0.001），Caspase-3和Caspase-8的mRNA、蛋白表達升高（P<0.01或P<0.001）。與模型組比，血必凈注射液組大鼠肺組織濕重/干重下降（P<0.05），IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18降低（P<0.05或P<0.01），肺組織損傷和炎癥浸潤情況明顯改善，細胞凋亡率下降（P<0.001），Caspase-3和Caspase-8的mRNA和蛋白表達降低（P<0.01或P<0.001）。結論 血必凈注射液可改善急性肺損傷大鼠的肺組織損傷和炎癥反應，其機制可能與抑制細胞凋亡有關。

〔關鍵詞〕 急性肺損傷;血必凈注射液;炎癥反應;細胞凋亡;胱天蛋白酶-3;胱天蛋白酶-8

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.002

Effects of Xuebijing Injection on inflammatory response and cell?apoptosis in rats with LPS-induced acute lung injury

LAI Guihua1，2，3， TAN Jinqu1，2，3， LI Mengmeng1，2，3， FU Chengxiao4， ZENG Yahua1，2，3， WANG Ting1，2，3，

WANG Juan1，2，3， LIAO Nian4， ZHOU Jun1，2，3， QU Mengjian1，2，3*

1. Rehabilitation Medicine Center， the First Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China;

2. Department of Rehabilitation， the First Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China;

3. Acupuncture & Rehabilitation Laboratory， the First Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China; 4. Department of Pharmacy， the First Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Xuebijing Injection （XBJI） on inflammatory response and cell apoptosis in rats with lipopolysaccharide （LPS）-induced acute lung injury （ALI）. Methods A total of 30 male SD rats were randomized into normal group （n=10） and modeling group （n=20） which was subdivided randomly into model group （n=10） and XBJI group （n=10） after modeling （injection of LPS into the tail vein）. The degree of pulmonary edema was evaluated using the wet/dry weight ratio （W/D） of the lung tissue， the serum levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β， IL-4， and IL-18 were determined by ELISA， the pathological damage of rat lung tissue was observed by HE staining， the condition of cell apoptosis was observed by TUNEL staining， and the mRNA content and protein levels of apoptotic factors Caspase-3 and Caspase-8 were measured by RT-PCR and Western blot. Results Compared with the normal group， the model group showed an increase in the rat lung tissue W/D （P<0.01）， levels of IL-6， IL-1β， IL-4， and IL-18 （P<0.001）， cell apoptosis rate （P<0.001）， as well as the mRNA and protein expressions of Caspase-3 and Caspase-8 （P<0.01 or P<0.001）; besides， the lung tissue was damaged with inflammatory cell infiltration. Compared with the model group， the XBJI group exhibited a decrease in the lung tissue W/D （P<0.05）， levels of IL-6， IL-1β， IL-4， and IL-18 （P<0.05 or P<0.01）， cell apoptosis rate （P<0.001）， as well as the mRNA and protein expressions of Caspase-3 and Caspase-8 （P<0.01 or P<0.001）; additionally， the damage to the lung tissue and inflammatory cell infiltration were significantly alleviated. Conclusion XBJI can relieve the lung tissue injury and inflammatory response in ALI rats， the mechanism of which may be related to inhibiting cell apoptosis.

〔Keywords〕 acute lung injury; Xuebijing Injection; inflammatory response; cell apoptosis; Caspase-3; Caspase-8

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）是臨床常見的急性彌漫性肺部疾病，主要表現為嚴重低氧血癥和肺水腫等，可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征和急性呼吸衰竭，病死率高達50%[1]。ALI的病因和發病機制復雜，嚴重感染、創傷、休克等是導致ALI發生的重要原因，其核心病機是肺內炎癥細胞過度激活，并釋放大量炎癥因子，導致炎癥級聯反應[2-3]。研究表明，細胞凋亡在ALI的發病過程中發揮重要作用，包括肺泡上皮細胞和內皮細胞凋亡引起的肺泡毛細血管屏障損傷，以及中性粒細胞凋亡對肺部炎癥微環境的改變等，這些凋亡過程大多與胱天蛋白酶-3（Caspase-3）和胱天蛋白酶-8（Caspase-8）等凋亡因子密切相關，抑制細胞凋亡可能是改善ALI炎癥反應的有效途徑[4]。

目前，ALI臨床常用的治療方法包括機械通氣、糖皮質激素藥物、血管擴張劑藥物、體外膜肺氧合和其他支持治療等，但這些治療并不能降低ALI的病死率，且存在一些不良反應、治療費用高[5]。因此，尋找高效、安全、經濟的治療方法仍是ALI的研究重點。近年來，中醫藥治療ALI的研究逐漸增多，其整體論治、標本兼顧的獨特優勢，在防治ALI方面發揮了重要的作用。中醫學認為，ALI的病因病機以熱毒、瘀血為主，治療上應以清熱解毒、活血化瘀為主。血必凈注射液是中國急救醫學奠基者王今達教授以血府逐瘀湯為基礎方，結合自身臨床經驗研制而成，在臨床上用于膿毒癥及ALI等嚴重炎癥性疾病，療效確切且安全性好[6]。目前，關于血必凈注射液抑制ALI炎癥反應的具體機制尚未完全明確。因此，本研究通過建立脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）所致的ALI大鼠模型，進一步評價血必凈注射液對ALI的治療作用，并從細胞凋亡的角度來闡述血必凈注射液治療ALI的可能作用機制，為其進一步的臨床應用提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1? 動物

8周齡清潔級SD雄性大鼠30只，購自長沙市天勤生物技術公司，生產許可證號：SCXK（湘）2022-0011。于南華大學實驗動物中心飼養，室溫21～25 ℃，相對濕度45%～65%，晝夜規律12 h/12 h，3只/籠，活動不受限，飼料及飲水充足，本實驗嚴格遵循《實驗動物管理條例》和南華大學附屬第一醫院醫學倫理委員會的相關規定（倫理批準號：202307210047）。

1.2? 主要實驗儀器和試劑

臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）;熒光定量RCP儀、PCR板（美國Thermo公司，型號：PIKOREAL96、SPL0960）;電泳儀、電泳槽、轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-2C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）;生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）;旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）;磁力攪拌器（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：JB-13）;熒光顯微鏡（德國Motic公司，型號：BA410T）。LPS（北京索萊寶科技有限公司，批號：3230506003）;血必凈注射液（天津紅日藥業股份有限公司，10 mL×5支，批號：2302261）;Caspase-3、Caspase-8、β-actin一抗（美國Proteintech公司，批號：66470-2-Ig、13423-1-AP、66009-1-Ig）;二抗（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：AWS0001）;mRNA逆轉錄試劑盒（康為世紀生物科技股份有限公司，批號：CW2569）;TUNEL試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批號：40306ES50]，HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）;IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18 ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：F4025、F4018、F4035、F4038）等。

1.3? 方法

1.3.1? 造模與分組? 將30只大鼠隨機分為正常組和造模組，造模后隨機分為模型組和血必凈注射液組，每組10只。造模方法[7]：大鼠用大鼠固定器固定實驗大鼠，選取大鼠尾靜脈1/3處，使用乙醇消毒，擴張局部血管，1 mL注射器抽取已配制的LPS溶液（根據人和動物的體表面積計算劑量）5 mg/kg，濃度5 mg/mL，斜45°進針后平行進針，回抽見靜脈血后緩慢注入LPS溶液，正常組尾靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3.2? 藥物干預? 造模1 h后，血必凈注射液組尾靜脈緩慢注射血必凈8 mL/kg（根據人和動物的體表面積計算法）[8]，1次/d，連續治療3 d，正常組和模型組同時間點注射等體積生理鹽水。

1.3.3? 標本采集和保存? 治療結束后，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射，對各組大鼠進行麻醉，先取大鼠眼眶血4 mL，離心后置于-80 ℃冰箱內保存，然后開胸暴露肺部，取肺組織，取右上肺計算肺組織濕重（W）/干重（D）比值，左肺進行HE染色及肺組織病理評估，右下肺置于液氮罐中低溫保存，用于RT-PCR和Western blot測定。

1.3.4? 觀察指標

（1）肺組織W/D測定

取待測肺組織，用濾紙吸干肺組織表面水分，然后用錫箔紙包裹，并精確稱取，其質量標記為肺組織W;將肺組織置于60 ℃烤箱中烘烤72 h后，測定其質量標記為肺組織D，計算肺組織W/D，評估肺組織水腫程度。

（2）ELISA檢測血清炎癥因子的含量

取大鼠血液樣本于無菌離心管中，室溫靜置1 h，將血液用離心機以4 ℃、4 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，取上清進行實驗檢測。實驗前20 min，從冰箱中取出ELISA試劑盒，平衡至室溫，嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中炎癥因子的含量。

（3）肺組織HE染色和病理評分

待測肺組織經固定、脫水、透明、包埋制成石蠟塊，用切片機將石蠟塊切成4 μm的薄片置于載玻片上，按照HE染色試劑盒說明書對肺組織切片進行染色，中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察肺組織損傷情況，借助NIS-Elements 4.6軟件對肺組織損傷情況進行評分。評分方法：對肺損傷后出現的肺泡充血、肺水腫、炎癥細胞浸潤及肺泡壁增厚程度4個病理改變表征進行分級評分，其中無損傷記為0分、輕度損傷記為1分、中度損傷記為2分、重度損傷記為3分、極重度損傷記為4分，各表征的評分之和為肺損傷病理評分。

（4）肺組織細胞凋亡TUNEL染色

大鼠肺組織石蠟切片脫蠟至水，加入蒸餾水浸洗5 min，隨后用Proteinase K工作液，37 ℃反應20 min;按照TUNEL試劑盒說明書操作染色，緩沖甘油封片后，置于熒光顯微鏡下采集圖像，計算細胞凋亡率，其中陽性細胞呈綠色熒光，正常細胞呈藍色熒光。每張切片隨機選取5個視野，計算各組大鼠肺組織的細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞（綠色熒光）/總細胞×100%。

（5）RT-PCR技術檢測Caspase-3和Caspase-8的mRNA含量

用Trizol試劑盒提取肺組織的總RNA，以組織總mRNA為模板，逆轉錄制備cDNA，在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer 5軟件設計引物，由北京擎科生物科技股份有限公司合成引物，相應引物進行RT-PCR反應，以β-actin作為內參，根據2-△△Ct公式計算Caspase-3和Caspase-8的mRNA相對表達量，引物序列見表1。

（6）Western blot檢測Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達

取大鼠肺組織加入RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量后上樣電泳轉膜，轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉處理1 h，分別加入Caspase-3和Caspase-8一抗（1∶2 000比例稀釋），4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000比例稀釋）室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3次，用ECL發光液避光顯影，使用Image J圖像分析軟件計算條帶的灰度值。

1.4? 統計學方法

采用SPSS 28.0軟件對數據進行統計學分析，用GraphPad Prism 8進行數據可視化，計量資料采用“x±s”表示，若多組均數比較符合正態分布，采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD法（方差齊）和Games-Howell法（方差不齊）;若多組均數不符合正態分布，則采用多樣本秩和檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠肺組織W/D

與正常組比，模型組大鼠肺組織W/D增高（P<0.01），提示LPS造模后ALI大鼠有明顯的肺水腫;血必凈注射液干預后，ALI大鼠肺組織W/D明顯降低（P<0.05），提示血必凈注射液可明顯緩解ALI大鼠的肺水腫程度。詳見表2。

2.2? 各組大鼠血清炎癥因子的含量

與正常組比，模型組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18的含量明顯增多（P<0.001）。與模型組比，血必凈注射液組大鼠中IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18的含量減少，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。詳見圖1。

2.3? 各組大鼠肺組織病理損傷情況及評分

HE染色顯示：正常組肺組織中肺泡結構正常，肺泡腔室清晰可見，肺泡壁細長且結構清晰，未見到明顯的充血/出血和炎癥細胞聚集。與正常組比，模型組大鼠肺組織中，肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞損傷，肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡腔炎癥細胞浸潤，部分肺泡結構消失、融合，肺泡壁和間隔明顯增厚。與模型組比，血必凈注射液組大鼠肺組織充血減少，大部分肺泡結構清晰可見，肺泡腔內炎癥細胞數量減少，詳見圖2。病理損傷評分顯示：與正常組比，模型組大鼠肺組織病理評分升高（P<0.001）;與模型組比，血必凈注射液組大鼠肺組織病理評分降低（P<0.01），詳見表3。

2.4? 各組大鼠肺組織細胞凋亡情況

正常組大鼠肺組織細胞凋亡率為8.96%±1.33%，模型組大鼠肺組織細胞凋亡率為58.51%±5.73%，模型組明顯高于正常組（P<0.001）。血必凈注射液組大鼠細胞凋亡率為19.52%±3.08%，明顯低于模型組（P<0.001）。詳見圖3。

2.5? 各組大鼠肺組織Caspase-3和Caspase-8的mRNA含量

與正常組比，模型組大鼠肺組織中Caspase-3和Caspase-8的mRNA含量增多（P<0.001）;與模型組比，血必凈注射液組大鼠肺組織Caspase-3和Caspase-8的mRNA含量降低（P<0.001）。詳見表4。

2.6? 各組大鼠肺組織Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達水平

與正常組比，ALI大鼠肺組織中Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達上升（P<0.01或P<0.001）;與模型組比，血必凈注射液組大鼠肺組織Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達明顯下降（P<0.01或P<0.001）。詳見圖4。

3 討論

中醫學并無“急性肺損傷”病名，臨床上根據呼吸窘迫、呼吸衰竭等癥狀，將急性肺損傷歸屬于“喘證”“喘脫”“暴喘”等范疇。中醫學認為，熱、毒、痰、瘀為ALI的重要病機。《溫熱論》云：“溫邪上受，首先犯肺。”[9]肺居高位，易受外邪侵襲，其中熱邪犯肺為主導，熱邪傷津耗氣，煉液為痰，痰濁黏滯，積久成毒，影響氣機運行，氣機運行不暢，導致血行緩慢，血液運行障礙，易產生瘀血[10]。因此，熱毒犯肺、痰瘀阻滯是ALI的主要病機，治療上應以清熱解毒、活血化瘀為關鍵。血必凈注射液具有清熱解毒、活血化瘀的功效，由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸組成。藥理學研究表明，其活性成分紅花黃色素、芍藥苷、川芎嗪、丹參素、阿魏酸等在抑制肺部炎癥反應、調節免疫、調控凋亡、保護血管內皮以及改善局部血液循環等方面均具有積極作用[11]。臨床研究表明，血必凈注射液干預ALI及膿毒癥等嚴重肺部炎癥疾病療效確切且安全性好[12]，已被納入多項指南、共識及國家級診療方案中推薦應用。此外，一項聯合血必凈注射液治療重癥病毒性肺炎的回顧性研究顯示，血必凈注射液可有效改善重癥病毒性肺炎的臨床體征，抑制炎癥反應，改善循環[13]。由此可見，血必凈注射液治療肺部感染疾病，尤其伴有嚴重的炎癥反應，具有較好的臨床療效。

可靠的ALI動物模型是實驗研究的重要載體。目前，ALI造模方法包括爆炸、海水等物理因素和LPS、石墨粉、百草枯、鹽酸等非物理因素誘導[14]。其中，LPS誘導的ALI模型是國內外研究者目前常用的模型（76.63%），LPS是存在于革蘭氏陰性菌外膜的糖脂，其病理機制是LPS可聚集和激活肺內的中性粒細胞，其釋放的氧自由基、彈性蛋白酶等進一步誘導巨噬細胞等免疫細胞釋放大量炎癥介質，進而引起炎癥級聯反應，最終導致ALI的發生[15]。LPS誘導的ALI動物模型重復性好、易于操作，且造模時間短、成功率高，并有利于研究細菌感染引起的炎癥反應，適用于ALI發病機制和藥效機制的研究[16]。因此，本研究選用LPS誘導的ALI模型來評價血必凈注射液的治療作用。實驗研究結果表明，經LPS造模后的SD大鼠肺部存在明顯的組織病理損傷、水腫及炎癥細胞浸潤情況，提示ALI模型構建成功。而血必凈注射液干預后，能夠明顯抑制ALI大鼠的炎癥反應，改善ALI肺損傷，提示血必凈注射液對于LPS引起的ALI大鼠具有較好的治療作用。過度炎癥反應在ALI中起著關鍵的作用，可直接或間接導致肺泡上皮和微血管內皮的損傷，是LPS所致ALI發生的根本原因。IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18是機體重要的炎癥介質，可誘導中性粒細胞在肺部聚集，從而加重炎癥反應。實驗研究表明，大鼠經LPS誘導后，能夠引起IL-4和IL-18的異常升高[17-18];而臨床相關研究表明，IL-6、IL-1β和IL-18可作為預測ALI病死率的重要生物標志物[19]。因此，選取以上4個炎癥因子作為評價ALI炎癥反應的重要指標。與文獻研究一致，本實驗結果顯示：ALI大鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-4和IL-18的含量顯著升高，而經血必凈注射液干預后，各炎癥因子含量明顯降低，表明血必凈注射液可有效抑制LPS所引起的肺部急性炎癥反應。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，研究表明，細胞凋亡與ALI的嚴重程度密切相關，肺泡上皮細胞、內皮細胞、中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等的異常凋亡，均可能導致ALI中上皮屏障功能受損和某些間充質細胞重構[20]。此外，凋亡細胞在肺組織中過度積累后，可釋放更多的炎癥介質，進一步加重肺部炎癥反應，并損傷肺組織，抑制細胞凋亡可有效抑制炎癥反應，并促進損傷肺組織恢復，表明抑制凋亡可能是一種有效的ALI治療策略。Caspase家族高特異性效應蛋白酶的激活是細胞凋亡的一個特征，其中，死亡執行蛋白酶Caspase-3是凋亡蛋白酶級聯反應過程中的關鍵因子，同時也是凋亡過程的最終執行者[21]。Caspase-8作為細胞凋亡的分子開關，可能在ALI的發病機制中起關鍵作用[22]。研究表明，在LPS誘導的ALI動物和細胞模型中，細胞凋亡因子Caspase-3和Caspase-8調控的炎癥反應明顯增強[23]。本實驗結果也顯示，ALI大鼠肺組織細胞凋亡率明顯升高，凋亡因子Caspase-3和Caspase-8升高，提示細胞凋亡在ALI的發病機制中具有重要的作用，經血必凈注射液干預后，肺組織的細胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-8的表達顯著降低，表明血必凈注射液能有效抑制LPS誘導的細胞凋亡，進而發揮治療ALI的作用。

綜上所述，血必凈注射液對LPS誘導的ALI大鼠肺組織損傷和炎癥反應，具有較好的改善作用，其作用機制可能與抑制肺組織細胞凋亡有關，但其確切的調控機制仍需進一步實驗研究。以上實驗結果為血必凈注射液的進一步臨床應用提供了實驗依據，后期需要進一步對血必凈注射液的其他調控機制進行深入探索。

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〔基金項目〕湖南省自然科學基金青年項目（2023JJ40595）;湖南省衛生健康委員會項目（202103100165）。

〔通信作者〕*屈萌艱，女，博士，主管技師，E-mail：524995799@qq.com。