血塞泰對(duì)缺血性腦卒中大鼠STIM1、Orai1蛋白表達(dá)的影響

鄭鈺 張逸凡 王子焱 劉承鑫 任欣 聶子星 郭志華 申思

本文引用： 鄭? 鈺， 張逸凡， 王子焱， 劉承鑫， 任? 欣， 聶子星， 郭志華， 申? 思. 血塞泰對(duì)缺血性腦卒中大鼠STIM1、Orai1蛋白表達(dá)的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（4）： 557-564.

〔摘要〕 目的 研究血塞泰對(duì)缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）大鼠基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1， STIM1）及鈣釋放激活鈣通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1， Orai1）的影響。方法 選取60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組10只、造模組50只，采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（medial cerebral artery occlusion， MCAO）模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的41只大鼠分為模型組、血塞泰低劑量組（12.6 g/kg）、血塞泰中劑量組（25.2 g/kg）、血塞泰高劑量組（50.4 g/kg）和阿司匹林腸溶片組（18 mg/kg），其中血塞泰低劑量組9只，其余每組各8只;假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。每組連續(xù)干預(yù)7 d。采用改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分（modified Neurological Severity Score， mNSS）評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能損傷情況，TTC染色法檢測(cè)大鼠腦組織的梗死面積，ELISA法測(cè)定大鼠血清中的白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量，RT-PCR檢測(cè)腦組織中STIM1、Orai1 mRNA的表達(dá)，免疫共沉淀檢測(cè)腦組織STIM1、Orai1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠mNSS評(píng)分增加（P<0.01），腦梗死率增加（P<0.01），血清IL-6、TNF-α含量增加（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P<0.01）。與模型組相比，血塞泰各劑量組和阿司匹林腸溶片組大鼠mNSS評(píng)分下降（P<0.05），血清IL-6、TNF-α含量下降（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平下降（P<0.01）;血塞泰中、高劑量組和阿司匹林腸溶片組大鼠腦梗死率下降（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。與阿司匹林腸溶片組相比，血塞泰低劑量組腦梗死率增加（P<0.01），血清IL-6、TNF-α含量增加（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平增加（P<0.05）;血塞泰中劑量組血清IL-6、TNF-α含量明顯增加（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平下降（P<0.05，P<0.01）;血塞泰高劑量組腦梗死率下降（P<0.01），血清IL-6、TNF-α含量明顯下降（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平明顯下降（P<0.01）。與血塞泰低、中劑量組相比，血塞泰高劑量組mNSS評(píng)分下降（P<0.05，P<0.01），腦梗死率下降（P<0.01），血清IL-6、TNF-α含量下降（P<0.01），腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平下降（P<0.01）。結(jié)論 血塞泰能夠抑制STIM1、Orai1的表達(dá)及結(jié)合，減輕炎癥反應(yīng)，改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損與降低神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮抗IS的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 缺血性腦卒中;血塞泰;基質(zhì)相互作用分子1;鈣釋放激活鈣通道蛋白1;炎癥

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R278? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.005

Effects of Xuesaitai on protein expressions of STIM1 and Orai1 in ischemic stroke rats

ZHENG Yu1，2， ZHANG Yifan1，2， WANG Ziyan1，2， LIU Chengxin1，2， REN Xin1，3， NIE Zixing1，2，?GUO Zhihua1，2，3*， SHEN Si1，3*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Xuesaitai on expressions of stromal interaction molecule 1 （STIM1） and calcium release-activated calcium channel protein 1 （Orai1） in ischemic stroke （IS） rats. Methods A total of 60 SPF-grade male SD rats were randomized into sham-operated group （n=10） and model group （n=50）. A middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was prepared by thread embolism. A total of 41 successfully modeled rats were randomly subdivided into model group， low-， medium-， and high-dose （12.6 g/kg， 25.2 g/kg， 50.4 g/kg） Xuesaitai groups， and enteric-coated aspirin tablets group （18 mg/kg）， with nine rats in low-dose Xuesaitai group and eight rats in each of the other groups. The sham-operated and model groups were given an equal volume of normal saline by gavage for continuous seven days. The modified Neurological Severity Score （mNSS） was used to assess the neurological damage in rats from each group， TTC staining was used to determine the infarct area of rat brain tissue， ELISA was used to measure the levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in rat serum， RT-PCR was used to check the mRNA expressions of STIM1 and Orai1 in brain tissue， and immunoprecipitation method was used to determine the relative protein expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue. Results Compared with the sham-operated group， the model group showed increased mNSS scores （P<0.01）， enlarged infarct area （P<0.01）， elevated serum levels of IL-6 and TNF-α （P<0.01）， and higher mRNA and relative protein expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue （P<0.01）. Compared with the model group， the rats in each dose group of Xuesaitai as well as enteric-coated aspirin tablets group showed decreased mNSS scores （P<0.05）， reduced serum levels of IL-6 and TNF-α （P<0.01）， and decreased mRNA expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue （P<0.01）. Additionally， the rats in the medium- and high-dose Xuesaitai groups， and enteric-coated aspirin tablets group exhibited decreased infarct area （P<0.01） and reduced relative protein expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue （P<0.05， P<0.01）. The high-dose Xuesaitai group exhibited lower cerebral infarct rate （P<0.01）， significantly reduced serum levels of IL-6 and TNF-α （P<0.01）， and significantly decreased mRNA expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue （P<0.01）. Compared with the low- and medium-dose Xuesaitai groups， the high-dose Xuesaitai group exhibited reduced mNSS scores （P<0.05， P<0.01）， lower cerebral infarct rate （P<0.01）， reduced serum levels of IL-6 and TNF-α （P<0.01）， and decreased mRNA expression levels of STIM1 and Orai1 in the brain tissue （P<0.01）. Conclusion Xuesaitai can inhibit the expression and binding of STIM1 and Orai1， alleviate the inflammatory response， relieve neurological deficits， and reduce neuronal damage in MCAO rats， thus exerting an anti-IS effect.

〔Keywords〕 ischemic stroke; Xuesaitai; stromal interaction molecule 1; calcium release-activated calcium channel protein 1; inflammation

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）是指由于腦血管阻塞導(dǎo)致腦部血液供應(yīng)不足而引起的腦功能障礙的疾病，是腦血管疾病中最常見(jiàn)的嚴(yán)重表現(xiàn)，也是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因之一[1-2]。恢復(fù)閉塞動(dòng)脈血流是挽救IS患者受損組織的首要前提，其次是抗血小板、抗凝血、保護(hù)神經(jīng)、改善血流等輔助治療[3]。血小板活化在IS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，并在IS后帶來(lái)多種危害，包括血栓形成、再灌注損傷和炎癥反應(yīng)[4-5]。實(shí)現(xiàn)血小板活化的主要途徑包括細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放和細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入，這些過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而觸發(fā)血小板活化[6-7]。鈣庫(kù)操作性鈣離子通道（store-operated calciumentry， SOCE）是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的關(guān)鍵機(jī)制。基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1， STIM1）和鈣釋放激活鈣通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1， Orai1）是SOCE的核心組成部分，它們通過(guò)相互作用共同調(diào)節(jié)儲(chǔ)存鈣通道的開(kāi)放，以確保細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡[8]。研究表明，STIM1/Orai1是激動(dòng)劑誘發(fā)血小板Ca2+內(nèi)流和病理性血栓形成的關(guān)鍵途徑[9]。小鼠血小板中STIM1或Orai1的缺乏會(huì)導(dǎo)致SOCE缺乏，并降低激動(dòng)劑刺激后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，抑制血栓形成[10]。

此外，IS后腦組織損傷會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞通過(guò)浸潤(rùn)受損腦組織，釋放炎癥介質(zhì)，破壞血腦屏障，導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高和腦死亡[11]。血小板活化和炎癥反應(yīng)在IS后相互影響。血小板活化可以促進(jìn)白細(xì)胞介素-1（interleukin-1， IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）等炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)則可以進(jìn)一步激活血小板和加劇腦損傷。

中醫(yī)在防治IS方面有著悠久的歷史。中藥治療IS具有多個(gè)靶點(diǎn)、多種途徑和協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，較傳統(tǒng)抗血小板藥物出血風(fēng)險(xiǎn)小。血塞泰是郭志華教授的經(jīng)驗(yàn)方，主要用于治療IS。前期的臨床研究結(jié)果顯示，血塞泰在IS患者的治療中表現(xiàn)出顯著的臨床療效，可明顯改善患者的臨床癥狀、提高其生活質(zhì)量[12-13]。然而，目前尚不清楚血塞泰在IS治療中的細(xì)胞分子生物學(xué)作用機(jī)制。本研究利用大腦中動(dòng)脈栓塞（medial cerebral artery occlusion， MCAO）大鼠模型，以STIM1、Orai1的表達(dá)為切入點(diǎn)，探究血塞泰的潛在作用機(jī)制，為血塞泰的臨床應(yīng)用提供新的研究證據(jù)。

1 材料和方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量280～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2020-0010，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。將大鼠置于不銹鋼頂格柵聚丙烯籠中飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，溫度保持在23～26 ℃，濕度為50%～70%，通風(fēng)良好，模擬12 h晝夜交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)[飼料種類(lèi)：普通大小鼠維持飼料，來(lái)源：湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2020-0006]，自由進(jìn)食及飲水。本實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20210813-15。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物

阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，規(guī)格：100 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字：HJ20160685）。鉤藤10 g、石菖蒲10 g（湖南仁上藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：2023012401、2023020601）;紅景天10 g、杜仲15 g（湖南衡岳中藥飲片有限公司，批號(hào)：23021901、23040901）;僵蠶15 g、丹參10 g、天麻15 g、葛根15 g、白術(shù)10 g（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號(hào)：NG23022703、HH23031601、SL23033103、HQ23020601、NG230413?01）;法半夏10 g（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號(hào)：D2302017）;川芎10 g（安徽亳藥千草國(guó)藥股份有限公司，批號(hào)：202302072）;炙甘草10 g（長(zhǎng)沙新林制藥有限公司，批號(hào)：230101）。所有藥材等比例混合，按10倍水量煎藥后過(guò)濾，再加入8倍水量煎，合并兩次煎出的藥液，放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 主要試劑

（0.38±0.02） mm線栓（北京西濃科技有限公司，批號(hào)：2838-A4）;RNA提取液、RIPA裂解液、PVDF膜、ECL試劑盒、吐溫-20、TBS緩沖液、抗體孵育盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G3013、G2002、WGPVDF45、G2014-50ML、GC204002-100ml、G0001-2L、G9055-4、G2003-50T）;IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)：J3066-A、J3056-A）;ORAI1抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：14442-1-ap）;辣根過(guò)氧化物酶-山羊抗小鼠、辣根過(guò)氧化物酶-山羊抗兔、ACTIN抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：GB23301、GB23303、GB11001）;STIM1抗體（英國(guó)Abcam PLC公司，批號(hào)：ab57834）。

1.4? 主要儀器

LEICA 819型徠卡刀片（上海徠卡儀器有限公司）;TG16W型微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）;HT-111B型恒溫?fù)u床（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）;SMV-3500型渦旋混勻儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）;D3024R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京DRAGONLAB公司）;6100型化學(xué)發(fā)光儀（上海Clinx公司）;CFX Connect型熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;RT-6100型酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

2 方法

2.1? 模型建立與評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[14]建立MCAO大鼠模型。完成7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，開(kāi)始制備MCAO模型。術(shù)前12 h禁食，不禁水。隨機(jī)抽取50只SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。仰臥位固定大鼠，備皮，沿頸正中線切開(kāi)皮膚1～1.5 cm，鈍性分離，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery， CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery， ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal car?otid artery， ICA），結(jié)扎CCA和ECA，將栓線插入CCA，當(dāng)栓線標(biāo)記點(diǎn)至ECA與ICA分叉處（插入20 mm）時(shí)，系牢栓線，于頸部皮膚切口處涂抹青霉素，縫合，術(shù)后保溫。其余10只大鼠作為假手術(shù)組，在切開(kāi)頸部皮膚后，消毒并縫合傷口，不插入線栓。所有大鼠于術(shù)后6 h可進(jìn)食、進(jìn)水。麻醉清醒24 h后，采用改良Zea-Longa評(píng)分法對(duì)大鼠的神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分為1～3分判定為造模成功[14]。

2.2? 動(dòng)物分組與給藥

依照隨機(jī)數(shù)字表法將成功造模的41只大鼠分為模型組，血塞泰低、中、高劑量組，阿司匹林腸溶片組，其中血塞泰低劑量組9只，其余每組各8只。從麻醉清醒24 h后開(kāi)始，每天在固定時(shí)間點(diǎn)灌胃1次。根據(jù)人和大鼠的體表面積折算法[15]，阿司匹林腸溶片組灌胃18 mg/kg;血塞泰低、中、高劑量組分別灌胃12.6、25.2、50.4 g/kg。假手術(shù)組和模型組，給予等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃。連續(xù)干預(yù)7 d后取材。

2.3? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能損傷情況

在治療7 d后，采用改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分（modified Neurological Severity Score， mNSS）評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能損傷情況[16]。mNSS包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡木、異常反射四項(xiàng)測(cè)試。分?jǐn)?shù)最高為18分，最低為0分，分?jǐn)?shù)越高代表神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

2.4? TTC染色法評(píng)估腦組織的梗死面積

第7天灌胃后，所有大鼠禁食不禁水12 h。每組選擇3只大鼠，取腦組織置于-20 ℃冰箱，冰凍30 min后切片。將切片放入2% TTC染液中，在37 ℃避光條件下染色30 min，之后使用移液槍吸出TTC染色液，接著加入4%多聚甲醛固定液固定24 h。拍照獲取圖像后，使用Image J軟件分析腦組織梗死率。腦梗死率（%）=梗死組織總面積/腦組織面積×100%。

2.5? ELISA測(cè)定血清TNF-α、IL-6的含量

取大鼠腹主動(dòng)脈血置于采血管中，室溫下靜置30 min，以4 ℃、3 000 r/min、離心10 min（離心半徑7 cm），吸取上清液于EP管中。使用IL-6、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中的OD值，樣品濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

2.6? RT-PCR檢測(cè)腦組織STIM1、Orai1 mRNA的表達(dá)

使用TRIzol試劑提取大鼠梗死側(cè)腦組織總RNA，并使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，在25 ℃保溫5 min，42 ℃保溫30 min，85 ℃保溫5 s的條件下，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃進(jìn)行30 s，95 ℃進(jìn)行15 s，60 ℃進(jìn)行30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)參，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列及片段長(zhǎng)度詳見(jiàn)表1。使用2-ΔΔCt方法分析相應(yīng)的基因表達(dá)結(jié)果。

2.7? 免疫共沉淀檢測(cè)腦組織STIM1、Orai1的蛋白表達(dá)水平

預(yù)先制備大鼠梗死側(cè)腦組織的蛋白裂解液。用protein A/G珠子及IgG，以4 ℃、2 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm），收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。適當(dāng)稀釋后，加入STIM1、Orai1抗體，4 ℃緩慢旋轉(zhuǎn)混合孵育過(guò)夜;第二天，加入protein A/G珠子，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合孵育2 h，4 ℃、2 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm）后棄上清液，收集免疫沉淀復(fù)合物。向沉淀蛋白中加入80 μL 1×還原型上樣緩沖液，100 ℃煮沸處理10 min，4 ℃、1 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm），收集上清液。從上清液中取10 μL樣品，進(jìn)行檢測(cè)。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“x±s”表示。對(duì)于滿足正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用最小顯著性差異法進(jìn)行各組間的兩兩比較。對(duì)于不滿足方差齊性的數(shù)據(jù)，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠mNSS評(píng)分情況

與假手術(shù)組相比，其余各組mNSS評(píng)分明顯增高（P<0.01）;與模型組相比，血塞泰各劑量組和阿司匹林腸溶片組mNSS評(píng)分降低（P<0.05）;與血塞泰低、中劑量組相比，血塞泰高劑量組mNSS評(píng)分降低（P<0.05，P<0.01）。詳見(jiàn)表2。

3.2? 各組大鼠腦梗死率

與假手術(shù)組相比，其余各組腦梗死率顯著增加（P<0.01）;與模型組相比，血塞泰中、高劑量組和阿司匹林腸溶片組腦梗死率顯著下降（P<0.01）;與阿司匹林腸溶片組相比，血塞泰低劑量組腦梗死率顯著增加（P<0.01），血塞泰高劑量組腦梗死率顯著下降（P<0.01）。血塞泰各劑量組腦梗死率隨含藥濃度增高而降低（P<0.01）。詳見(jiàn)圖1、表3。

3.3? 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平

與假手術(shù)組相比，其余各組血清IL-6、TNF-α含量顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，血塞泰各劑量組和阿司匹林腸溶片組血清IL-6、TNF-α含量顯著降低（P<0.01）;與阿司匹林腸溶片組相比，血塞泰低、中劑量組血清IL-6、TNF-α含量顯著升高（P<0.01），血塞泰高劑量組血清IL-6、TNF-α含量顯著降低（P<0.01）。血塞泰各劑量組血清IL-6、TNF-α含量隨含藥濃度增高而降低（P<0.01）。詳見(jiàn)表4。

3.4? 各組大鼠腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，其余各組腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，血塞泰各劑量組和阿司匹林腸溶片組腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）;與阿司匹林腸溶片組相比，血塞泰低劑量組腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)表達(dá)水平升高（P<0.05），血塞泰中、高劑量組腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。血塞泰各劑量組腦組織STIM1、Orai1mRNA表達(dá)水平隨含藥濃度增高而降低（P<0.01）。詳見(jiàn)表5。

3.5? 各組大鼠腦組織STIM1、Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，模型組、阿司匹林腸溶片組和血塞泰低劑量組腦組織STIM1、Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，血塞泰中、高劑量組和阿司匹林腸溶片組腦組織STIM1、Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）;與阿司匹林腸溶片組相比，血塞泰高劑量組腦組織Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05）;與血塞泰低劑量組相比，血塞泰中、高劑量組腦組織STIM1、Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。詳見(jiàn)圖2、表6。

4 討論

IS屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，病機(jī)可概括為風(fēng)、火、痰、瘀、虛5個(gè)方面。中醫(yī)理論認(rèn)為，痰和瘀貫穿于中風(fēng)發(fā)病的全過(guò)程。痰、瘀留滯于臟腑經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致氣機(jī)運(yùn)行失暢。氣不順則生風(fēng)，風(fēng)邪裹挾痰、瘀上犯于腦絡(luò)血管及肢體經(jīng)絡(luò)、蒙蔽神竅，繼而導(dǎo)致中風(fēng)的發(fā)生。因此，中風(fēng)的治療多采用息風(fēng)化痰通絡(luò)法[17-18]。血塞泰由僵蠶、丹參、天麻、鉤藤、石菖蒲、紅景天、川芎、葛根、白術(shù)、半夏、杜仲、炙甘草12味藥組成。方中僵蠶息風(fēng)止痙、化痰通絡(luò)，丹參活血化瘀，天麻平肝息風(fēng)，三者風(fēng)、痰、瘀并治，共為君藥;鉤藤清熱平肝，石菖蒲豁痰開(kāi)竅，紅景天養(yǎng)血活血，川芎為“血中氣藥”，助以丹參、紅景天活血之效，共為臣藥;佐以葛根解肌升陽(yáng)、通利經(jīng)脈，白術(shù)、半夏祛濕化痰，杜仲補(bǔ)益肝腎;使以炙甘草補(bǔ)中益氣、調(diào)和諸藥。全方共奏祛風(fēng)化痰、活血通絡(luò)之功。藥理研究表明，天麻素可延長(zhǎng)凝血時(shí)間，降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[19]。天麻中的對(duì)羥基苯甲醇可通過(guò)抑制家兔血小板細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，防止血小板聚集[20]。石菖蒲揮發(fā)油有降低血小板活性、抗血小板聚集、防止血栓形成的作用[21]。丹參酮ⅡA可抑制紅細(xì)胞聚集、促進(jìn)血液循環(huán)、抵抗血小板黏附、防止血栓形成[22]。王新東等[23]研究發(fā)現(xiàn)，含有丹參酮ⅡA的中藥制劑黃芪丹參水煎液可抑制大鼠心肌組織中STIM1的表達(dá)。侯培媚等[24]研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶提取物能促進(jìn)全腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)域抗炎因子的表達(dá)，并能恢復(fù)神經(jīng)元損傷和行為功能。葛根素可改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能、腦梗死面積和腦水腫體積[25]。以上說(shuō)明血塞泰具有減輕IS后神經(jīng)元損傷、抑制血小板活化的潛力。

IS是最常見(jiàn)的腦血管疾病之一，全世界每年約有110多萬(wàn)人死于IS，IS對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害[26]。血小板活化會(huì)誘發(fā)IS[27]，在IS急性期，聯(lián)合使用抗血小板藥物可以有效預(yù)防IS的再次發(fā)生[28]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加是血小板活化的必要條件[29]。SOCE的核心蛋白STIM1和Orai1通過(guò)允許細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)血小板活化。GROSSE等[30]研究發(fā)現(xiàn)，STIM1激活的小鼠具有更高的Ca2+水平和循環(huán)血小板預(yù)激活，證實(shí)STIM1能觸發(fā)血小板活化。缺乏Orai1的小鼠血小板SOCE受損，血小板的黏附及促凝作用下降[31]。阿司匹林可以通過(guò)阻斷血小板激活因子血栓素A2的合成，抑制血小板活化[32]。研究證實(shí)，阿司匹林能夠阻斷及逆轉(zhuǎn)STIM1-Orai1的相互作用[33]，其代謝產(chǎn)物水楊酸鹽可抑制SOCE[34]。此外，應(yīng)激和壞死的神經(jīng)元通過(guò)釋放損傷相關(guān)分子模式，上調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[35]。炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6等能夠驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)缺血腦組織，而免疫細(xì)胞的募集又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，最終損害血腦屏障，加速腦損傷[36]。抑制MCAO大鼠IL-6、TNF-α的釋放可以保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫[37]。

腦缺血、缺氧和能量代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭。STIM1屬于SOCE的Ca2+傳感器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存耗盡時(shí)，STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜上的Orai1相互作用，激活Ca2+內(nèi)流[38]。SOCE通道過(guò)度激活，會(huì)引發(fā)神經(jīng)元興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)功能障礙[39]。研究證實(shí)，IS大鼠海馬組織中STIM1和Orai1蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均增加，抑制STIM1的表達(dá)可減少神經(jīng)元的凋亡[40]。缺乏STIM1和Orai1骨髓嵌合體的小鼠在MCAO誘導(dǎo)后24 h的腦組織梗死體積顯著降低[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，血塞泰中、高劑量組大鼠mNSS評(píng)分、腦組織梗死面積降低;血塞泰低劑量組大鼠mNSS評(píng)分下降;血塞泰各劑量組大鼠腦組織STIM1、Orai1 mRNA表達(dá)水平降低;血塞泰中、高劑量組大鼠腦組織STIM1和Orai1的結(jié)合度下降。說(shuō)明血塞泰可改善IS后腦組織損傷面積和mNSS評(píng)分，下調(diào)STIM1和Orai1的表達(dá)，抑制STIM1和Orai1的結(jié)合，從而發(fā)揮抗IS的作用。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，與模型組相比，血塞泰各劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α水平下降，表明血塞泰能夠減輕IS后的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，血塞泰能夠抑制STIM1、Orai1的表達(dá)及結(jié)合度，減輕炎癥反應(yīng)，改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損與降低神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮抗IS的作用。本研究為血塞泰的臨床應(yīng)用提供了證據(jù)，與治療IS的傳統(tǒng)西藥相比，血塞泰在治療IS方面具有安全性高、療效顯著的特點(diǎn)。但考慮到中藥的作用機(jī)制通常是涉及多靶點(diǎn)、多通道和多層次的綜合調(diào)控，對(duì)于血塞泰治療IS的深入作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金（81673955）;湖南省衛(wèi)生健康委科研計(jì)劃項(xiàng)目（202203074016）;湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20230832）。

〔通信作者〕*申? 思，女，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：472075891@qq.com;郭志華，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：guozhihua112@163.com。