水蒸氣蒸餾法提取橙皮中檸檬烯的實驗研究

尉樺聰,張新茹,姚吉,高云,全艷玲,徐靜

(遼寧科技大學 化學工程學院,遼寧 鞍山 114051)

橙子主要盛產于我國南部地區,栽植范圍在甘肅、陜西二省南部、湖北、湖南、江蘇、貴州、廣西及云南東北部的高山地區均有分布[1-2]。橙子作為水果在日常食用或果蔬行業食品加工的同時會殘留無法直接食用的果皮等廢物。目前,橙子果皮的處理除少量用于生產動物飼料外,其余被歸類為廚余垃圾,長期的堆積給環境帶來一定的負擔。因此,對橙皮中富含的活性成分首先進行提取和分離后再進行殘渣處理,不僅可以實現自然資源物盡其用,而且能提高橘橙柚等農產品綜合利用效率和產品的附加值,又能減少因果皮堆積產生的環境污染問題[3-4]。橙皮經過一定的物理和化學處理,可得到具有高利用價值的橙香精油,提取的精油中有90%以上的成分為檸檬烯。檸檬烯是存在于橙皮中的芳香油,具有令人愉快的香味,具有特殊的抑菌和殺菌等微生物的特性,是一種常見的天然香料、脫脂劑和抗菌消炎劑,在醫藥、食品、化妝品和日用化學品等領域有廣泛的應用[5-8]。

近年來,國內外學者逐漸關注對橘橙柚果皮的化學活性成分分布及有機化學結構的研究。檸檬烯的密度為0.840 2 g/cm3,在常溫常壓下是一種淡黃色或者接近無色的油狀液體,不溶于水。從橙皮中提取檸檬烯的實驗室方法諸多,如索氏溶劑提取法、超臨界固-液萃取法和水蒸氣蒸餾法等[8]。水蒸汽蒸餾法是實驗室提取不與水反應且具有較高沸點和一定揮發性物質(100 ℃時蒸氣壓至少為1.3 kPa)的最簡單最常用的方法。

以新鮮橙皮為原料,對影響水蒸氣蒸餾法提取檸檬烯的因素進行了分析,確定提高檸檬烯產率最佳實驗條件。提供一種方便、快捷,且產率較高的檸檬烯提取方法,為柑橘橙柚類果皮資源廢棄物的綜合利用提供一定理論依據和借鑒參考。文章最后對橙皮中提取的檸檬烯進行定量和定性的表征分析,并對檸檬烯的抑菌性能和最小抑菌濃度測定。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

橙皮來源于湖北宜昌的秭歸臍橙,2023年9月份網購于上述產地。氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉和乙醇均為分析純試劑購于國藥試劑。金黃色葡萄球菌等生物試劑購買于青島海博生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

將新鮮橙皮切成不同尺寸碎片備用。稱取經過預處理的橙皮質量m1=50 g,置于250 mL裝有兩粒沸石的三口圓底燒瓶中,加入100 mL蒸餾水,三口圓底燒瓶的左右瓶口分別連接水蒸氣發生器的導管與直型冷凝管,提取的橙皮油經過直型冷凝管引流到錐形瓶中。水蒸氣發生裝置產生的水蒸氣導入三口瓶中,使瓶內保持微沸狀態,從錐形瓶內的第一滴餾出液開始計時直到精油量不再增加后停止反應,大約1 h。將少量無水硫酸鈉放入錐形瓶中去除水分,得到檸檬烯的質量為m2,檸檬烯的產率計算依據公式:Y=m2/m1。

1.3 分析與表征

采用美國安捷倫科技有限公司7890A/5975C氣相質譜分析儀分析檸檬烯的成分和純度。以氦氣作為載氣,EI 源作為質譜電子轟擊離子源,溫度設定為230 ℃,全掃描模式的掃描范圍為 50～500 amu。

采用Thermo Electron公司的 NICOLET 380紅外光譜儀(FT-IR)分析橙皮精油的有機物化學官能團。樣品以溴化鉀干燥、研磨和制粒,其光譜記錄在4 000～400 cm-1的范圍內,分辨率為4 cm-1,每個樣品掃描20次。

1.4 檸檬烯抑菌效果及最小抑菌濃度測定

采用牛津杯法對檸檬烯原液進行抑菌效果測定。將1 mL 稀釋后金黃色葡萄菌懸液于一次性培養皿內,使培養基與菌懸液混合均勻,待培養基凝固后用無菌鑷子夾取牛津杯放置于培養基上,按壓牛津杯直至接觸到培養皿底部,用鑷子將牛津杯及牛津杯內部培養基取出。分別吸取 10 μL檸檬烯原液垂直滴至培養基上的小孔內,將培養皿放置于 37 ℃ 恒溫培養箱內24 h,進行抑菌圈直徑測量。將檸檬烯用體積分數40%乙醇溶液稀釋,通過二倍稀釋法至質量分數為10.00‰,5.00‰,2.50‰,1.25‰,0.63‰,0.31‰。設置對照組A(體積分數40%乙醇)和B(只接種菌懸液)。分別吸取 0.3 mL 檸檬烯稀釋液及陽性對照 A 和B于試管中,加入 3 mL 稀釋后菌液密閉狀態反應 30 min。反應結束后取 1 mL溶液置于一次性培養皿中,確保溶液與營養瓊脂培養基混合均勻。待培養基完全凝固后,將培養皿置于恒溫培養箱內保持37 ℃恒溫培養24 h,進行菌落計數,確定最小抑菌濃度。

2 結果與討論

2.1 橙皮尺寸對檸檬烯提取率的影響

將新鮮橙皮破碎成不同尺寸,考察原料尺寸(0.2 cm×0.2 cm,0.4 cm×0.4 cm,0.6 cm×0.6 cm,0.8 cm×0.8 cm)對檸檬烯提取率的影響。設定的水蒸氣蒸餾時間30 min,優化水蒸氣蒸餾提取新鮮橙皮中液相產物進而獲得提取高純度檸檬烯的工藝參數,橙皮尺寸對檸檬烯提取率的影響如圖1所示。

圖1 橙皮尺寸對檸檬烯提取率的影響

由圖1可知,橙皮尺寸由0.2 cm×0.2 cm 增大到0.6 cm×0.6 cm,檸檬烯的提取率呈現上升趨勢;當尺寸繼續增大到0.8 cm×0.8 cm,提取率呈現下降趨勢。這可能是由于橙皮尺寸較大時,橙皮組織中液態化合物擴散到表層的距離增加,擴散過程橙皮組織的內部熱傳遞阻力有所提高,橙皮在水氣中不完全反應,組織內部富含精油的化合物不容易被提取出來。橙皮尺寸為0.6 cm×0.6 cm時,橙皮組織中液態化合物擴散到表層的距離減小,擴散過程橙皮組織的內部熱傳遞阻力有所降低,橙皮在水氣中反應完全,促使組織內部富含精油的化合物被充分提取出來。但是,當橙皮尺寸減小至0.2 cm×0.2 cm時,橙皮組織之間的空隙相對較小,水氣難以擴散到橙皮內部,并且阻塞富含精油的化合物從表層逸出,檸檬烯在反應體系中滯留時間延長,檸檬烯提取率下降。綜上所述,確定橙皮尺寸0.6 cm×0.6 cm為水蒸氣蒸餾提取橙皮中檸檬烯的最佳工藝參數。

2.2 橙皮浸泡時間對檸檬烯提取率的影響

橙皮中水分含量是影響水蒸氣蒸餾法提取檸檬烯產率的重要影響因素。橙皮本身水分含量高,在水蒸氣蒸餾的反應體系中自身的水分可以促進檸檬烯成分從橙皮中轉移出來。然而,當橙皮中的水含量較低時,由于缺少自身原位水將富含檸檬烯的化合物從橙皮中萃取出來。但是當橙皮中含水率高于70%時,橙皮易腐爛變質導致提取率降低。因此水蒸氣蒸餾前對橙皮進行一定浸泡是必要的,考察時間(0,2,4,6,8,10 h),結果如圖2所示。

圖2 橙皮浸泡時間對檸檬烯提取率的影響

圖2表明,當橙皮碎片的預先浸泡時間為8 h時,檸檬烯最終的提取率最高。水蒸氣蒸餾前,橙皮碎片的浸泡時間對檸檬烯的提取率影響較大,當橙皮的浸泡時間不足8 h時,橙皮中的富含檸檬烯的化合物不能被最大化的帶出,隨著浸泡時間的增加檸檬烯提取率逐漸升高;當浸泡時間高于8 h時,橙皮溶脹現象嚴重,目標產物分離困難,且含有少量雜質,提取率略有下降。

2.3 添加劑種類對檸檬烯提取率的影響

采用水蒸氣蒸餾的方法時,添加無機鹽助劑是影響檸檬烯的提取率的重要因素。本實驗選擇NaCl、Na2CO3、NaHCO3、CaCO3為添加助劑。由圖3可知,加入四種無機鹽助劑后,檸檬烯的提取率高于不添加無機鹽時的提取率。不同試劑的加入對檸檬烯提取率的促進作用大小順序如下:Na2CO3>NaHCO3>NaCl>CaCO3。CaCO3極難溶于水,不易與橙皮中的檸檬烯發生鹽析作用。強電解質NaCl的加入,使檸檬烯的提取率略有提高,這是由于中性的鹽溶液中的鹽離子與溶液中大部分自由水結合,使橙皮中的檸檬烯更容易聚集析出。Na2CO3和NaHCO3的鹽析作用大于中性鹽NaCl,由于Na2CO3和NaHCO3的水溶液都是強堿性,堿處理可解構橙皮碎片中纖維細胞壁,從而可有效促進檸檬烯組分的萃取。無機鹽Na2CO3的堿性強于NaHCO3,以Na2CO3為添加助劑時,水蒸氣蒸餾橙皮中檸檬烯的提取率為3.43%。

圖3 不同添加劑對檸檬烯提取率的影響

2.4 添加劑比例對檸檬烯提取率的影響

選擇Na2CO3的添加比例分別為新鮮橙皮質量的2%,4%,6%,8%,考察Na2CO3在水溶液中添加比例對檸檬烯提取率的影響,結果如圖4所示。

圖4 添加劑質量比例對檸檬烯提取率的影響

Na2CO3的添加質量比例從0%增加到2%的過程中,檸檬烯的提取率顯著增加;當Na2CO3的添加質量比例從2%增加到4%的過程中,檸檬烯的提取率增加緩慢,添加質量比例超過4%以后檸檬烯的提取率開始下降。在Na2CO3添加質量比例低于4%時,在橙皮水溶液中鹽的濃度相對較低,體系內的飽和蒸氣壓隨著Na2CO3濃度的增加而降低,故在恒定大氣壓的情況下,水的沸點升高[10],水蒸氣蒸餾中水蒸氣產量減少造成檸檬烯提取率下降。綜合考慮檸檬烯提取率和能耗等方面因素,確定最佳的Na2CO3添加質量比例為4%。

2.5 檸檬烯的氣相質譜分析

本實驗確定的最佳實驗條件為:選取0.6 cm×0.6 cm橙皮50 g,預先浸泡8 h后加入4%的碳酸鈉,進行水蒸氣蒸餾 1 h提取檸檬烯。檸檬烯的分子式為C10H16,C10H16具有多種同分異構化合物,如表1所示。其中,CAS號99-84-3為本實驗的目標產物d-檸檬烯。

表1 C10H16的同分異構化合物

將最佳工藝條件下,橙皮中提取的揮發性成分進行GC-MS 測定,以確定提取物中d-檸檬烯的純度。GC-MS 分析的檸檬烯總離子流圖如圖5所示。根據 NIST標準譜圖庫對GC-MS采集的色譜峰進行定性匹配,結果表明保留時間為 7.791 min 的組分確定為目標產品d-檸檬烯,氣相體積含量為96.3%。

圖5 橙皮中揮發性成分的總離子流圖

2.6 檸檬烯的紅外光譜分析

檸檬烯的紅外光譜如圖6所示,相關紅外光譜特征吸收峰歸屬如下:797.04和885.46 cm-1為碳氫鍵( C-H) 的彎曲振動,1 644.62 cm-1為碳碳雙鍵(C=C) 的平面伸縮振動,2 917.15 cm-1和2 965.02 cm-1為碳氫鍵(C-H) 的伸縮振動峰。

圖6 檸檬烯的紅外譜圖

2.7 檸檬烯的抑菌性能及最小抑菌濃度

檸檬烯對金黃色葡萄球菌抑菌作用明顯,抑菌圈直徑(32.47±1.26)mm。檸檬烯對金黃色葡萄球菌的抑菌測試結果,如圖7所示。

圖7 檸檬烯對金黃色葡萄球菌抑菌效果

當采用 40%乙醇做乳化劑稀釋檸檬烯原液時,當檸檬烯質量分數為0.31‰時,抑菌率低于10%;當檸檬烯質量分數為0.63‰時,抑菌率均為82%;當檸檬烯質量分數等于或高于1.25‰時,檸檬烯的抑菌率均為100%,檸檬烯的最小抑菌質量分數為1.25‰。

3 結論

水蒸氣蒸餾法提取新鮮橙皮中檸檬烯具有設備簡單、流程方便、適合實驗室操作的優點。本實驗選擇原料破碎尺寸、原料預處理時間、無機添加物、添加劑比例作為影響因素,確定橙皮中檸檬烯提取工藝的最優條件為0.6 cm×0.6 cm橙皮50 g,預先用100 mL蒸餾水浸泡8 h后加入4%的碳酸鈉,水蒸氣蒸餾時間為1 h。在此條件下,檸檬烯的產率為3.66%,對金黃色球葡萄菌的最小抑菌質量分數為1.25‰。以水蒸氣蒸餾的方法從橙皮中提取檸檬烯的實驗研究,可為橘橙柚類果皮中有用成分的提取和分離工藝研究提供數據參考,并具有實際應用價值。