hsa_circ_0013058促進食管鱗狀細胞癌侵襲和遷移的機制研究

談 艷, 陶菲兒, 王成海, 3

(1. 揚州大學醫學院 病理學教研室, 江蘇 揚州, 225009;2. 江蘇省揚州洪泉醫院 放療中心, 江蘇 揚州, 225200;3. 江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001)

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是食管癌組織學亞型[1-2]。環狀核糖核酸(circRNA)是非編碼RNA的一種類型,其參與多種癌癥的增殖、侵襲和轉移等生物學過程[3-4]。circRNA一直被認為是微小RNA(miRNA)海綿來調節下游靶基因,可作為促癌基因和抑癌基因影響ESCC的形成和進展[5-6]。研究[7]表明, ciRS-7中和了miR-7在體外和體內對ESCC細胞增殖和遷移的抑制作用。目前,食管癌的發病機制尚未闡明。本研究通過已有的circRNA表達譜芯片技術獲得ESCC的差異表達circRNAs, 其中hsa_circ_0013058表達水平上調,并得到驗證[8]。本研究探討hsa_circ_0013058對ESCC細胞侵襲、遷移的作用機制,以期為臨床治療轉移性ESCC提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

75例新鮮的ESCC組織和鄰近正常食管組織來源于揚州大學附屬醫院和揚州洪泉醫院外科手術患者。患者手術時間為2021年6月—2023年6月,年齡為38～72歲,中位年齡為54歲; 男42例,女33例。所有患者手術前均未進行化療或放療。新鮮標本采集后,立即放入液氮罐,于-80 ℃冰箱內保存,以備后期實驗使用。根據美國癌癥聯合委員會TNM食管癌分期標準(第8版)對實驗樣本分期進行評估[8]。本研究經揚州洪泉醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞和材料

人正常食管上皮細胞Het-1A(#BFN60806666, BLUEFBIO, 中國)、ESCC細胞株KYSE70(#ACC-379, 低分化鱗狀細胞瘤, DSMZ, 德國)。細胞株在RPMI-1640培養基(#PM150110A, Procell, 武漢,中國)中培養,并添加青霉素G(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和10%胎牛血清(#10093, ThermoFisher)。所有細胞在37 ℃、5% CO2的增濕空氣中培養。LPAR3抗體和GAPDH購自美國Abcam。hsa_circ_0013058過表達和敲低表達的質粒由Thermofisher中國生物工程公司合成。轉染試劑盒Lipofectamine3000、LPAR3 單抗(#PA5-33496)和GAPDH單抗(#MA1-16757)購買于Invitrogen公司,轉染步驟按說明書進行。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測

采用總RNA提取試劑盒分離腫瘤組織或細胞后,提取總RNA, -80 ℃儲存。使用Ambion試劑盒(美國Life Technologies公司)將總RNA合成cDNA, 然后使用KOD SYBR qPCR Mix(日本Toyobo Life Science公司)進行qPCR分析。熱循環條件: 98 ℃ 2 min; 98 ℃ 10 s, 61 ℃ 30 s, 40個循環。使用2-△△Cq計算評估hsa_circ_0013058表達水平,內參為GAPDH。引物序列: hsa_circ_0013058正向引物為5′-AACGTGAGCGGATGTTCACT-3′, 反向引物為5′-ACAGGCAGAAAAACGTCCCA-3′;GAPDH正向引物為5′-GAGTCACTGGCGTCTTCAC-3′, 反向引物為5′-TGCTGATGATCTTGAGGCTTT-3′。

1.4 RNA原位分子雜交實驗(RISH)

hsa_circ_0013058 RNA探針和原位雜交試劑盒購于武漢BOSTER生物公司。RISH實驗步驟按試劑說明書進行。雜交結果判定標準: 細胞中出現棕黃色物質,則為hsa_circ_0013058陽性病例; 實驗設陽性對照組和不加探針的空白對照。寡核苷酸探針序列: AUGAAGACGGUGAUGACUGUCCAGUCAUCACCGUCUUCAUUA; ACAGUGUCCAACCUCAUGGCCCCAUGAGGUUGGACACUGUCC。

1.5 劃痕實驗

所有器械滅菌,直尺和記號筆在操作前進行紫外線照射。先用記號筆在6孔板背后,參照直尺,均勻地劃橫線,每隔0.5～1.0 cm劃一道,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線。加入約5×105個細胞,保證過夜能鋪滿。第2天用槍頭參照直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕。去除劃下的細胞,加入無血清培養基,置于37 ℃、5%CO2培養箱培養。第0、24、48小時分別取樣,拍照。

1.6 Transwell遷移和侵襲實驗

細胞遷移實驗: 用無血清細胞培養液制備成單個腫瘤細胞懸液。每個檢測樣品上室內加0.2 mL懸液,下室內添加有血清的培養液0.6 mL, 置于培養箱內孵育24 h。將小室取出,棉簽擦掉基質膠及沒穿膜的細胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 95%乙醇固定15 min, 結晶紫染色。隨機選擇5個光鏡視野,統計遷移細胞數量。細胞侵襲實驗: 腫瘤細胞用無血清細胞培養液制備成單細胞懸浮液。把Matrigel于4 ℃融化,吸取50 μg Matrigel添加到95 μL的無血清細胞培養液內,將稀釋以后的Matrigel添加到Transwell小室內,轉移到37 ℃孵育1 h。后續實驗過程與細胞遷移實驗相同。

1.7 生物信息學預測hsa_circ_0013058的下游靶基因及驗證

hsa_circ_0013058和微小RNA(miR)-548p的下游靶基因預測網站分別為circinteractome.nia.nih.gov、www.targetscan.org和mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php。采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-548p下游靶基因。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)檢測蛋白表達

在轉染48 h 的KYSE70細胞中加入RIPA緩沖液,于冰上裂解以提取總蛋白, 10 000 r/min離心10 min, 收集上清液。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白樣本,將分離的蛋白條帶轉移到聚二氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h; 然后將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。第2天,室溫下將膜與二抗孵育2 h。采用化學發光法顯色,拍照并計算條帶相對灰度值。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測hsa_circ_0013058、miR-548p表達

在ESCC中, hsa_circ_0013058表達水平(3.323±0.203)高于癌旁正常組織(NC), 差異有統計學意義(t=5.078,P<0.05); miR-548p表達水平(0.654±0.027)低于癌旁正常組織,差異有統計學意義(t=4.675,P<0.05)。ESCC細胞株KYSE70 中hsa_circ_0013058表達水平(2.967±0.348)高于人正常食管上皮細胞Het-1A的(1.567±0.186), 差異有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析顯示,在RNA水平上hsa_circ_0013058與miR-548p呈負相關(r=-0.254 2,P<0.05)。該實驗提示hsa_circ_0013058在ESCC中可能發揮促癌基因作用,而miR-548p在ESCC中可能發揮抑癌基因作用。見圖1。

2.2 RISH實驗檢測hsa_circ_0013058的陽性表達

RNA原位雜交實驗結果表明,75例ESCC組織中hsa_circ_0013058 RNA陽性染色為大小不等的棕黃色物質,主要定位于細胞質中,而在癌旁正常食管組織中幾乎沒有陽性表達。ESCC組織hsa_circ_0013058陽性率為72.00%(54/75), 高于癌旁正常組織的17.33%(13/75), 差異有統計學意義(χ2=6.862,P<0.05)。見圖2。

2.3 ESCC中hsa_circ_0013058表達與臨床病理特征的關系

75例ESCC組織根據陽性染色結果分為hsa_circ_0013058陽性組(n=54)和hsa_circ_0013058陰性組(n=21)。hsa_circ_0013058表達與腫瘤浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移均密切相關(P<0.05), 而與患者年齡、性別、腫瘤直徑和TNM分期均無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 ESCC組織中hsa_circ_0013058表達與臨床病理特征的關系

2.4 劃痕實驗結果

過表達hsa_circ_0013058后,劃痕傷口距離[(1.15±0.08) mm]短于對照[(3.45±0.12) mm], 差異有統計學意義(P<0.05), 提示過表達hsa_circ_0013058增強了KYSE70細胞系的遷移能力。敲低hsa_circ_0013058表達后,劃痕傷口距離[(5.62±0.11) mm]長于對照[(3.24±0.12) mm], 差異有統計學意義(P<0.05), 提示敲低hsa_circ_0013058表達減弱了KYSE70細胞系的遷移能力。見圖3。

2.5 hsa_circ_0013058對ESCC細胞侵襲和遷移的影響

Transwell實驗結果表明,與對照比較[(59.8±6.21)個],過表達hsa_circ_0013058后ESCC細胞的侵襲數目增多[(83.60±7.22)個],敲低hsa_circ_0013058表達后ESCC細胞的侵襲數目減少[(28.86±4.24)個],差異有統計學意義(P<0.05)。與對照相比[(56.85±7.21)個],過表達hsa_circ_0013058后ESCC細胞的遷移數目增多[(83.61±8.98)個],敲低hsa_circ_0013058表達后ESCC細胞遷移數目減少[(25.82±6.48)個],差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.6 hsa_circ_0013058的下游靶基因預測及驗證

hsa_circ_0013058預測的下游miRNA一共22個,根據結合位點數目>7個且context+score percentile>90分進行篩選,僅miR-548p符合上述條件。同時改變hsa_circ_0013058的表達后miR-548p也隨之變化(見圖5),提示miR-548p是hsa_circ_0013058的下游靶基因。預測miR-548p的下游靶基因是LPAR3, 通過雙熒光素酶報告基因實驗(見圖6)得出在LPAR33′UTR野生型轉染中, miR-548p高表達可抑制相應的熒光素酶活性,而在miR-548p突變中卻沒有熒光素酶活性的抑制作用。因此miR-548p與LPAR3為特異性結合,LPAR3是miR-548p的直接靶基因。

2.7 hsa_circ_0013058對ESCC細胞中miR-548p/LPAR3信號通路和侵襲、遷移的影響

回復實驗的實驗分組如下,1組: 對照; 2組: hsa_circ_0013058過表達; 3組: hsa_circ_0013058敲低; 4組: hsa_circ_0013058過表達+miR-548p過表達; 5組: hsa_circ_0013058過表達+miR-548p敲低; 6組: hsa_circ_0013058敲低+miR-548p過表達; 7組: hsa_circ_0013058敲低+miR-548p敲低。結果顯示,過表達hsa_circ_0013058后,miR-548p表達水平下降,而敲低hsa_circ_0013058表達后, miR-548p的表達水平升高(見圖7A), 進一步說明hsa_circ_0013058直接調控miR-548p。在變化hsa_circ_0013058或/和miR-548p的表達后,通過Western blot檢測LPAR蛋白變化,結果顯示,無論hsa_circ_0013058和miR-548p如何變化, LPAR3蛋白表達量均出現變化(見圖7B),說明LPAR3受hsa_circ_0013058的調控。以上結果表明, hsa_circ_0013058抑制miR-548p的表達,進而激活LPAR3信號通路,促進ESCC細胞的侵襲和遷移。Transwell侵襲和遷移實驗表明,過表達miR-548p能抑制hsa_circ_0013058對食管癌的侵襲、遷移的促進作用,而降低miR-548p表達可增強ESCC細胞的侵襲、遷移能力(見圖7C、表2)。

表2 ESCC細胞侵襲、遷移數目和LPAR3蛋白表達水平

3 討 論

食管癌是一種起源于食管鱗狀上皮細胞或食管腺上皮細胞的惡性腫瘤。目前, ESCC的治療方式包括手術切除、放療、化療和免疫治療,均取得了一定進展,但晚期轉移性ESCC的臨床療效仍不理想[9-11]。因此,迫切需要探討有效的生物標志物,以更好預測ESCC患者的預后。研究[12]表明, hsa_cir_0006168(circCNOT6L)在ESCC組織和細胞系中均高表達。高表達circCNOT6L與ESCC患者的淋巴結轉移和TNM分期有關,其通過miR-100/mTOR軸促進ESCC細胞增殖、遷移和侵襲[13]。研究[14]表明, circ-FAT1在ESCC組織中的表達水平顯著低于癌旁非腫瘤組織; circ-FAT1通過在體外吸收miR-548g來抑制ESCC細胞的侵襲和遷移,從而發揮腫瘤抑制因子作用。hsa_cir_0001666在ESCC組織和ESCC患者血漿中均下調[15], 與腫瘤大小呈負相關, hsa_cir_0001666低表達患者的預后較差。外源性hsa_cir_0001666抑制ESCC細胞的增殖、侵襲和遷移。研究[16]發現, circDOCK5的表達水平在ESCC組織中下調, circDOCK5通過發揮海綿作用增加miR-627-3p的穩定性,并部分抑制TGFB2的表達和轉化生長因子-β的分泌,抑制細胞上皮間質轉化。

本研究結果表明, hsa_circ_0013058為促癌基因,在ESCC組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織,且在ESCC細胞中呈陽性表達; hsa_circ_0013058表達與腫瘤浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移均密切相關,其陽性表達率越高,腫瘤越易發生局部浸潤和淋巴結轉移。由此提示, hsa_circ_0013058參與了癌細胞的局部浸潤、轉移,可用于評估患者預后,有望成為浸潤和轉移性ESCC的生物標記物。本研究中,劃痕實驗和Transwell實驗表明hsa_circ_0013058可促進ESCC細胞的浸潤和遷移。本研究通過生物信息學預測了hsa_circ_0013058的下游靶基因是miR-548p, 并通過qRT-PCR驗證了hsa_circ_0013058與miR-548p呈負相關,提示hsa_circ_0013058發揮促癌基因功能,而miR-548p發揮抑癌基因功能,其共同參與了ESCC的發生發展。此外,本研究預測了miR-548p下游靶基因是LPAR3, 并通過雙熒光素酶報告基因實驗進行了驗證,結果表明, miR-548p可直接調控LPAR3蛋白表達。本研究回復實驗結果表明, hsa_circ_0013058可調控miR-548p的表達; 抑制miR-548p的表達可激活LPAR3信號通路,促進癌細胞的浸潤和遷移。本研究探討了hsa_circ_0013058在ESCC細胞侵襲、遷移中的作用機制,為今后診斷、治療轉移性食管癌提供了理論依據。

綜上所述, hsa_circ_0013058通過下調miR-548p表達,激活LPAR3信號通路,進而促進ESCC細胞的侵襲和遷移。