組蛋白去甲基化酶JMJD2E抑制肝癌細胞惡性進展的研究*

李曉華 鄭志剛

福建醫科大學附屬福州市第一醫院 1 乳腺外科 2 普通外科,福建省福州市 350009

肝癌是一種嚴重威脅全球公共衛生的高度致命惡性腫瘤,特征為快速生長、高度浸潤性和廣泛轉移。肝癌的診斷常在晚期,限制了有效治療的機會。據世界衛生組織報告,肝癌已成為全球第四大癌癥致死原因,每年導致近一百萬人死亡,給全球衛生系統和患者家庭造成了沉重的負擔[1]。現有治療方法包括手術、放射、化療等,但晚期患者的治療效果有限[2]。因此,尋找新的治療策略和靶點以提高患者的生存率和生活質量至關重要。組蛋白修飾控制著染色質的功能,而JMJD2家族成員(特別是JMJD2E)是調節這些修飾的關鍵。可以解除染色質的緊密結合,從而激活與細胞增殖、生長和轉錄調控相關的基因,這種活動可能導致腫瘤細胞中致癌基因的過度表達,從而促進腫瘤生長和擴散[3]。microRNA-372(miR372)已被證明在幾種人類癌癥中發揮重要作用。同時,在多種癌細胞中也發現了JMJD2E對miR372的調控作用[4]。本研究主要探討JMJD2E在肝癌細胞中的作用機制,以及其與miR372之間的調控關系。

1 實驗方法

1.1 體外肝癌細胞生長影響檢測 為了深入探究JMJD2E對肝癌細胞增殖的影響,筆者構建了穩定表達JMJD2E的Hep3B細胞株。為了驗證JMJD2E對細胞增殖的潛在抑制作用,筆者設計了CCK8實驗來定量分析細胞活力。此外,為了評估其對細胞克隆能力的影響,筆者進行了菌落形成效率實驗,其中細胞被種植在平皿中,允許形成可見菌落,進一步以結晶紫染色和計數來確定菌落數量,這些實驗的設計旨在模擬細胞在無限制條件下的生長能力。

1.2 體內肝癌細胞生長影響檢測 在體內實驗中,筆者采用了異種移植模型來評估JMJD2E在活體內對肝癌細胞生長的影響。通過將JMJD2E轉染的Hep3B細胞懸浮液注射到Balb/C小鼠的皮下,筆者建立了腫瘤生長模型。腫瘤生長被定期監測,隨后腫瘤被摘除并稱重,以物理量度來評估腫瘤體積變化。此外,筆者對摘除的腫瘤進行了詳盡的組織學分析,包括HE染色,以確定腫瘤的細胞學特征和異質性,從而提供對JMJD2E在體內抑制肝癌細胞生長效果的直接證據。

1.3 JMJD2E對miR372表達影響檢測 考慮到miR372在肝癌發展中的潛在角色,筆者采用了一系列分子生物學技術來研究JMJD2E如何調節其表達。利用RT-PCR和Western blotting,筆者定量分析了miR372及其相關轉錄因子的mRNA和蛋白表達水平。通過CHIP實驗,筆者評估了JMJD2E對miR372啟動子區域結合蛋白的影響。EMSA和RIP實驗被用來研究特定蛋白與miR372啟動子區域的相互作用,以及這些相互作用對miR372表達調節的潛在影響。這些技術的綜合使用使筆者能夠全面地分析JMJD2E對miR372表達的調控作用。

2 結果

2.1 JMJD2E在體外抑制肝癌細胞生長 筆者研究了JMJD2E對Hep3B肝癌細胞生長的影響。通過建立兩個Hep3B細胞株,一個作為對照組(轉染pCMV6-AC-GFP),另一個過表達JMJD2E(轉染pCMV6-AC-GFP-JMJD2E),筆者通過RT-PCR和Western blotting確認了JMJD2E的表達水平。實驗結果表明,JMJD2E顯著抑制了細胞的增殖(見圖1a),過量的JMJD2E顯著減少了生長肝癌細胞Hep3B含量(見圖1b)。同時,JMJD2E顯著抑制了菌落形成(見圖1c),BrdU標記的增殖率也顯著降低(見圖1d)。驗證了JMJD2E能減緩Hep3B細胞的惡性生長。

圖1 JMJD2E在體外抑制肝癌細胞生長

2.2 JMJD2E在體內抑制肝癌細胞生長 筆者進一步在Balb/C小鼠模型中研究了JMJD2E的體內效果(Balb/C小鼠腋下皮下注射轉染了pCMV6-AC-GFP、pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B細胞后形成的異種移植腫瘤)。JMJD2E的過表達顯著減少了小鼠體內異種移植腫瘤的重量(見圖2a、b),并且腫瘤組織學分析腫瘤切片蘇木精—伊紅(HE)染色結果顯示低分化細胞減少(見圖2c)。這些結果表明,JMJD2E在體內也能抑制肝癌細胞的生長。

圖2 JMJD2E在體內抑制肝癌細胞生長

2.3 JMJD2E在表觀遺傳學上減弱miR372的表達 考慮到JMJD2E與miR372在肝癌中可能的負相關關系,筆者檢查了JMJD2E對miR372表達的影響。筆者在轉染了pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B細胞系中,觀察到JMJD2E的過表達(見圖3a)。筆者發現JMJD2E促進了H3K36me3和DNMT1與miR372啟動子的相互作用,增加了甲基化(見圖3b、c)。此外,筆者發現JMJD2E促進了miR372啟動子區域的甲基化(見圖3d)。JMJD2E還減少了CRE元件的活性及多個轉錄因子的負載(見圖3e～g),并抑制了CTCF介導的染色質環的形成,影響了CREB、P300、RNApolII進入該環(見圖3h)。這導致了miR372各個成熟階段的顯著降低(見圖3i、j)。這些發現支持了JMJD2E通過表觀遺傳學機制抑制miR372,從而可能影響肝癌細胞的惡性行為。

圖3 JMJD2E在表觀遺傳學上減弱miR372的表達

3 討論

肝癌是一種高度惡性的癌癥,尋找有效的治療靶點對于提高患者生存率至關重要[5]。本研究探討了組蛋白去甲基化酶JMJD2E在肝癌細胞中的作用及其與miR372的關系。首先,筆者通過轉染穩定的Hep3B細胞株,發現JMJD2E的高表達顯著抑制了細胞的增殖和生長,并降低了集落形成效率。此外,異種移植實驗進一步證明了JMJD2E的抑制效應。在分子水平上,JMJD2E過表達導致JMJD2E mRNA和蛋白的顯著降低。筆者進一步研究了JMJD2E對miR372的表觀遺傳學調控機制。實驗結果表明,JMJD2E促進了miR372啟動子區域的甲基化,并降低了關鍵調節因子如CREB、P300和RNApolII在該區域的負載。這導致了miR372的表達和成熟的顯著降低。總的來說,本研究揭示了JMJD2E在抑制肝癌細胞的生長和在表觀遺傳學水平上減弱miR372的表達中的關鍵作用,為肝癌治療提供了新的潛在靶點和策略。

以鉑為基礎的藥物如順鉑(cisplatin,CP)是非小細胞肺癌(NSCLC)的一線化療藥物。相關研究結果顯示,JMJD2去甲基化酶是克服NSCLC CP耐藥性的潛在治療靶點[6]。Chen等[7]研究顯示,JMJD2D在多發性惡性腫瘤,特別是結直腸癌(CRC)和肝細胞癌(HCC)的進展中也是一種成熟的表觀遺傳促進因子。LI等[8]研究人員發現,JMJD2A通過下調腫瘤抑制因子miR-491-5p促進宮頸癌細胞生長并抑制細胞凋亡。因此,JMJD2家族在多種癌癥類型中的異常表達與癌癥的發病和進展密切相關。深入了解JMJD2酶家族在癌癥發展中的確切作用和分子機制將有助于揭示新的治療靶點和癌癥干預策略,為癌癥患者的治療提供新的希望[9]。筆者的研究揭示了JMJD2E在人肝癌細胞株Hep3B中的抑制作用。通過轉染穩定的Hep3B細胞株,筆者證實了JMJD2E的高表達能夠顯著減少Hep3B細胞的增殖和生長。這一現象在分子水平上得到了支持,因為JMJD2E的過表達導致了JMJD2E mRNA和蛋白的顯著降低。此外,集落形成實驗和BrdU陽性率測定結果均表明,JMJD2E的高表達可顯著降低Hep3B細胞的集落形成效率和增殖活性。更具意義的是,筆者的體內異種移植實驗進一步證明了JMJD2E的抑制效應,因為JMJD2E的過表達使異種移植物腫瘤的生長明顯減緩,同時還導致了腫瘤組織中低分化細胞的減少,表明JMJD2E在調控肝癌細胞生長方面發揮著關鍵作用。

Lin等[10]研究觀察表明,miR372通過miR372-YB-1-β-catenin-LEF/TCF4-PKM2-erbB-2軸激活癌細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)-細胞周期蛋白 E-P21/Cip1復合物來促進肝臟周期進程,提示miR372可以作為肝癌的一種新的治療靶點。另一項研究結果表明,miR-372抑制了在肝癌中高度表達的 ATAD2的表達,并在肝癌發展中發揮了原癌基因的作用[11]。同時,在多種癌癥類型中,miR-372的過表達已被觀察到,特別是在肝癌、乳腺癌、肺癌和結直腸癌等腫瘤中。這種過表達與腫瘤細胞的增殖和侵襲能力的增強相關,可能通過抑制抑癌基因的表達以及促進癌基因的表達來推動腫瘤生長和擴散[12]。筆者進一步研究了JMJD2E與miR372之間的調控機制,特別是在表觀遺傳學水平上。前期研究已經發現JMJD2E在人肝癌組織中與miR372呈負相關,因此筆者對JMJD2E是否能夠減弱miR372的表達進行了深入探究。本研究發現,在JMJD2E過表達的Hep3B細胞中,JMJD2E促進了H3K36me3與miR372啟動子之間的相互作用,這可能導致miR372的抑制。此外,JMJD2E還增加了DNMT1與miR372啟動子之間的相互作用,導致miR372啟動子區域的甲基化增加。這些結果表明JMJD2E通過改變染色質結構和甲基化狀態,以及對關鍵調節因子如CREB、P300和RNApolII的調控,抑制了miR372的正常表達和成熟。總體而言,JMJD2E在表觀遺傳學水平上對miR372的抑制作用揭示了其在肝癌發展中的潛在重要性。

總之,組蛋白去甲基化酶JMJD2E可抑制肝癌細胞的惡性進展,其機制可能與抑制miR372的表達相關。這些研究結果不僅有助于深入理解JMJD2E在肝癌中的作用機制,還為肝癌治療和相關疾病的治療策略提供了新的見解和潛在靶點。然而,仍需進一步研究以確定JMJD2E與miR372之間的分子交互作用的詳細機制,并且需要進一步研究確定其在肝癌發展中的具體調控網絡。