PD-L1及微血管密度在肉瘤樣腎細胞癌中的表達及意義

趙 媛,陳 紅,謝 燕,李 寧,金木蘭

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,2020年約占全球所有惡性腫瘤新發(fā)病例的2.2%,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其中,伴肉瘤樣分化的腎細胞癌常被稱為肉瘤樣腎細胞癌(sarcomatoid renal cell carcinoma, sRCC),該腫瘤呈低分化或未分化狀態(tài),通常為WHO/ISUP 4級,進展迅速,生物學行為較常見的腎癌更具侵襲性,預后較差,大多數(shù)患者在1年內(nèi)死于腫瘤轉移[1]。盡管靶向治療有效延長了晚期RCC患者的生存期,但該治療方法對sRCC患者的療效有限。研究表明,RCC中肉瘤樣成分的存在可能導致靶向治療的耐藥性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),PD-1和PD-L1在sRCC中的表達水平顯著高于非sRCC,提示阻斷PD-1/PD-L1軸可能是一種新的治療策略[3]。研究顯示,在RCC治療中采用PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合靶向治療的療效優(yōu)于單用靶向治療,并且可以有效延長患者的無進展生存期和提高客觀緩解率[4]。本研究納入16例sRCC,探討腫瘤組織中PD-L1表達、腫瘤內(nèi)微血管密度及其與sRCC預后的關系,為進一步探索sRCC免疫治療及靶向治療方案提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集并篩選2016年1月～2022年12月在首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院經(jīng)病理確診的16例sRCC患者(癌成分均為透明細胞腎細胞癌)。收集患者臨床病理資料包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、肉瘤樣區(qū)域占比、病理TNM分期、治療及預后情況。影像學監(jiān)測腫瘤的復發(fā)、轉移情況。無進展生存期 (progression free survival, PFS)定義為患者接受治療至患者出現(xiàn)腫瘤進展或末次隨訪日。總生存期(overall survival, OS)定義為患者術后至各種原因導致死亡的時間或末次隨訪日。本研究經(jīng)北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準,遵循《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》和《赫爾辛基宣言》實施。所有患者均知情同意。

1.2 方法組織標本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,5 μm厚切片,HE染色,光鏡下觀察。免疫組化一抗包括PD-L1、CD31和CD34,其中PD-L1(SP263)購自美國羅氏公司,使用Bench Mark ULTRA全自動免疫組化染色平臺檢測PD-L1的表達,CD31和CD34購自北京中杉金橋公司,免疫組化染色采用EnVision兩步法。

通過免疫組化法檢測PD-L1在sRCC腫瘤細胞(tumor cell, TC)和腫瘤相關免疫細胞(immune cell, IC)中的表達。IC包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、漿細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。TC PD-L1判讀：任意強度的、部分或完全細胞膜PD-L1染色的腫瘤細胞占標本中所有腫瘤細胞的百分比。腫瘤細胞質(zhì)染色、腫瘤內(nèi)間質(zhì)及壞死區(qū)域不包含在評判范圍內(nèi)。IC PD-L1陽性判讀：腫瘤區(qū)域內(nèi)、任意強度的、細胞質(zhì)或細胞膜PD-L1染色的免疫細胞所占腫瘤面積的百分比。腫瘤面積包含腫瘤細胞、腫瘤內(nèi)間質(zhì)及腫瘤周圍連續(xù)性相關間質(zhì),不包含壞死區(qū)域。采用聯(lián)合陽性評分(combined positive score, CPS)來代表TC及IC聯(lián)合表達,結果用0～100數(shù)值來表示。當計算結果超過100時,最終結果按100來計算[4]。所有染色的組織樣本均由2名泌尿生殖病理專業(yè)的病理醫(yī)師進行復核。

通過免疫組化法檢測CD31和CD34的表達情況[5]。單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇的胞膜和(或)胞質(zhì)染色視為陽性,可用于微血管密度(microvessel density, MVD)計數(shù),不計瘤細胞稀少區(qū)、硬化區(qū)及其接近正常組織區(qū)域的微血管數(shù)量。微血管密度計數(shù)方法：先在100倍光鏡下觀察切片確定腫瘤內(nèi)血管密度最高處,選取CD31、CD34陽性染色較多的熱點區(qū)(5個),再在200倍光鏡下在各熱點區(qū)范圍內(nèi)進行MVD計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法計量資料以均數(shù)±標準差表示,計數(shù)資料以率或百分比表示,兩組均數(shù)間的比較應用t檢驗。采用Kaplan-Meier曲線描繪患者的總體生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征16例sRCC臨床病理特征見表1,其中男性12例(75.0%),女性4例(25.0%),男女比為3∶1,年齡31～75歲,中位年齡53.5歲。5例(31.3%)腫瘤位于左腎,11例(68.7%)腫瘤位于右腎。腫瘤最大徑4.0～13.5 cm,中位最大徑7.0 cm。肉瘤樣區(qū)域占腫瘤瘤體5%～70%不等。根據(jù)WHO/ISUP腫瘤分級系統(tǒng),腎細胞癌伴有肉瘤樣分化WHO/ISUP分級均為G4。病理TNM分期Ⅰ～Ⅳ期患者分別為3例(18.8%)、3例(18.8%)、7例(43.7%)、3例(18.8%)。所有患者均接受腎癌根治術,其中分期為pT1的2例患者術后定期復查,未接受其他治療,其余患者在術后根據(jù)病情變化應用了靶向治療或免疫治療。

2.2 MVD檢測結果對本組16例sRCC進行組織學觀察,16例sRCC腫瘤組織中同時含有癌和肉瘤樣成分,肉瘤樣區(qū)域腫瘤細胞呈梭形,彌漫片狀分布(圖1A),癌成分均為透明細胞腎細胞癌(圖1B)。腫瘤中微血管呈網(wǎng)狀、管狀散在或彌漫分布,血管形態(tài)差異性較大。CD31免疫組化標記的肉瘤樣分化區(qū)域MVD計數(shù)為68.6±25.8,不伴肉瘤樣分化區(qū)域的MVD計數(shù)為38.7±16.0,肉瘤樣分化區(qū)域MVD明顯高于不伴肉瘤樣分化的區(qū)域(圖1C、D),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000 5,表2);CD34免疫組化標記的肉瘤樣分化區(qū)域MVD計數(shù)為69.5±28.1,周邊不伴肉瘤樣分化區(qū)域MVD計數(shù)為40.1±18.4,肉瘤樣分化區(qū)域MVD明顯高于不伴肉瘤樣分化的區(qū)域(圖1E、F),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001 5,表2)。

圖1 A.肉瘤樣腎細胞癌的肉瘤樣區(qū)域：腫瘤細胞呈梭形,彌漫片狀分布,胞質(zhì)嗜酸性;B.肉瘤樣腎細胞癌的非肉瘤樣區(qū)域：腫瘤細胞胞質(zhì)透明,呈現(xiàn)透明細胞腎細胞癌形態(tài);C.CD31免疫組化標記的肉瘤樣腎細胞癌肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細胞,EnVision法;D. CD31免疫組化標記的肉瘤樣腎細胞癌非肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細胞,EnVision法;E.CD34免疫組化標記的肉瘤樣腎細胞癌肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細胞,EnVision法;F. CD34免疫組化標記的肉瘤樣腎細胞癌非肉瘤樣區(qū)域微血管內(nèi)皮細胞,EnVision法;G. PD-L1在肉瘤樣腎細胞癌肉瘤樣區(qū)域中的表達,EnVision法;H.PD-L1在肉瘤樣腎細胞癌非肉瘤樣區(qū)域中的表達,EnVision法

表2 肉瘤樣腎細胞癌中肉瘤樣區(qū)域與非肉瘤樣區(qū)域MVD計數(shù)及PD-L1表達情況

2.3 PD-L1表達情況16例sRCC中肉瘤樣區(qū)域與非肉瘤樣區(qū)域PD-L1染色結果顯示(圖1G、H,表1),肉瘤樣區(qū)域PD-L1的CPS為34.7±26.9,非肉瘤樣區(qū)域PD-L1的CPS為25.9±27.6。肉瘤樣區(qū)域PD-L1的表達水平高于非肉瘤樣區(qū)域,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.357 6,表2)。

2.4 隨訪及預后對所有患者進行隨訪,中位隨訪時間36.5個月(10～84個月),14例患者出現(xiàn)腫瘤進展,其中7例患者死亡,患者總體生存曲線見圖2。

圖2 16例肉瘤樣腎細胞癌患者的總體生存曲線圖

3 討論

sRCC是一種去分化的癌,它并不是一個獨立的組織學類型,任何RCC亞型都可能伴有肉瘤樣成分,其復發(fā)率、轉移率高,總體預后差。傳統(tǒng)療法對sRCC的療效不佳,中位OS約為19個月[6]。對于sRCC,目前尚無有效的系統(tǒng)治療方法。隨著靶向治療藥物(如舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼等)的出現(xiàn),RCC患者的預后生存得到了一定程度的改善[7]。分子靶向藥物的主要作用機制是通過抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤生長。血管生成是指腫瘤附近血管的增殖和出芽,在腫瘤的增殖和進展中起著至關重要的作用[8]。MVD是最常用的量化腫瘤內(nèi)血管生成的參數(shù),也是衡量腫瘤血管生成的金標準,在肺癌、乳腺癌和結直腸癌中是公認的預后相關因素[9-11]。然而,一些研究發(fā)現(xiàn),在RCC患者中MVD與OS之間無明顯相關性[5]。Yao等[12]認為RCC中存在兩種微血管類型：未分化型微血管和分化型微血管。該研究認為分化型微血管比例越高,惡性程度越低,預后越好;未分化型微血管比例越高,惡性程度越高,預后越差,即未分化型MVD是RCC患者的獨立預后因素。臨床對檢測MVD計數(shù)的常用指標為CD31和CD34。CD31是泛內(nèi)皮細胞標志物,不僅與新形成的微血管有關,也涉及腫瘤中已有的血管。CD34常在血管周細胞中表達,但在正常血管內(nèi)皮和淋巴內(nèi)皮中表達較少,因此能突出顯示較小的、不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細胞[5]。本研究發(fā)現(xiàn),sRCC中血管密度增加,尤其是CD34標記的未成熟血管數(shù)量增加,MVD計數(shù)高于非肉瘤樣區(qū)域,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 5),提示sRCC可能從抑制血管生成的靶向治療中獲益。

隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展,免疫治療被認為是治療高危腎癌的一種有前景的治療方法。研究發(fā)現(xiàn),sRCC中PD-1和PD-L1的表達量明顯高于普通病理類型的腎癌,同時腫瘤相關淋巴細胞的浸潤也較高。Kawakami等[3]發(fā)現(xiàn),與非肉瘤性4級透明細胞腎細胞癌相比,伴肉瘤樣分化的透明細胞腎細胞癌的PD-L1表達更高。該研究表明,sRCC中PD-1/PD-L1的表達比例可能比非sRCC更高。本研究對16例sRCC腫瘤組織進行了PD-1和PD-L1免疫組化染色,所有患者腫瘤組織PD-L1均有不同程度表達,且肉瘤樣區(qū)域的陽性百分比均高于非肉瘤樣區(qū)域,但差異無統(tǒng)計學意義。基于本研究結果及其他研究報道,sRCC患者有可能從免疫治療中獲益。

在組織學方面,腎細胞癌具有豐富的血管和腫瘤浸潤淋巴細胞。因此,抗血管生成靶向藥物和免疫檢查點抑制劑有望在腎癌聯(lián)合治療中發(fā)揮協(xié)同增效作用。研究顯示,靶向藥物聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制劑在晚期RCC的治療中獲得了良好的療效。例如,KEYNOTE-426臨床研究對帕博利珠單抗和阿昔替尼聯(lián)合與舒尼替尼單藥治療晚期腎細胞癌療效進行了比較。有研究顯示,與舒尼替尼相比,聯(lián)合治療組患者的PFS明顯延長(15.4個月vs11.1個月,P<0.000 1),客觀緩解率顯著提高(59.3%vs35.7%,P<0.000 1),并且無論患者PD-L1的表達狀況如何,聯(lián)合治療組均可獲益[13-14]。CLEAR研究顯示,侖伐替尼聯(lián)合帕博利珠單抗與舒尼替尼相比,患者的PFS得到明顯延長(23.9個月vs9.2個月,P<0.001),聯(lián)合治療組的OS也優(yōu)于舒尼替尼組(P=0.005),并且聯(lián)合治療組的客觀緩解率達71%,明顯優(yōu)于其他藥物的臨床研究數(shù)據(jù)[15]。因此,聯(lián)合靶向治療和免疫治療,與單獨使用靶向治療或免疫治療相比,可有效改善晚期RCC的治療效果。一項研究顯示,與65例單獨接受舒尼替尼治療的sRCC患者相比,74例接受伊匹單抗聯(lián)合納武單抗治療的患者中位PFS、中位OS、完全緩解率和局部緩解率均顯著增加[16]。因此,靶向治療聯(lián)合免疫治療也可能成為sRCC潛在有效的治療方法。

本研究顯示,采用靶向治療聯(lián)合免疫治療的sRCC患者,相比于單獨采用靶向治療者,PFS與OS均有所提升。例如,例13在腎癌根治術后第50個月發(fā)現(xiàn)腫瘤進展,應用靶向聯(lián)合免疫治療,目前隨訪69個月病情平穩(wěn),相比于同為pT3期、僅追加靶向治療的患者,其預后明顯改善。例14在腎癌根治術后第16個月發(fā)現(xiàn)腫瘤肺轉移,應用索拉非尼靶向治療,未聯(lián)合免疫治療,于術后第25個月去世;而同為pT4期的例15,在腎癌根治術后第19個月發(fā)現(xiàn)腫瘤肺轉移,應用靶向治療聯(lián)合免疫治療,目前隨訪30個月患者仍生存,腫瘤控制平穩(wěn)。例16在腎癌根治術后第8個月時腫瘤復發(fā),應用靶向治療聯(lián)合免疫治療后,于第29個月去世;而同為pT4期且復發(fā)后未聯(lián)合免疫治療的例14,其復發(fā)后生存期僅9個月,兩者相比,前者復發(fā)后生存期更長(21個月vs9個月),提示靶向聯(lián)合免疫治療在延長sRCC患者OS方面可能發(fā)揮潛在改善作用。

綜上,sRCC較為少見,患者預后較差,靶向聯(lián)合免疫治療可能是此類患者臨床治療方案中的一項重要選擇。然而,本研究樣本量小,可能存在選擇偏差,未來還需要更大樣本的前瞻性研究來驗證本研究的結果。