基于TCGA數據集分析LINC00900在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

黎 春,郭陳剛,逯素梅,馬萬山△

1.山東大學山東省千佛山醫院檢驗部,山東濟南 250000;2.山東省德州市中西醫結合醫院檢驗科,山東德州 253000;3.德州學院生物物理研究所/生物物理重點實驗室,山東德州 253000

近30年來,甲狀腺癌的發病率明顯上升,其最常見的病理組織類型為甲狀腺乳頭狀癌(PTC),占90%左右[1]。PTC又可分為多種病理亞型,常見的有經典型、高細胞亞型、濾泡亞型等,不同病理亞型的預后不同,相對于經典型和濾泡型,高細胞亞型的預后更差。大部分PTC患者可以通過手術或放射碘治愈,預后良好,但有10%左右的患者發展為預后不良的甲狀腺癌或出現疾病復發[1-2]。目前,臨床對于甲狀腺癌手術的范圍仍存在爭議,對患者預后進行有效評估,有助于在降低手術風險和提高患者預后之間找到平衡點。有研究證實,包括TNM分期系統在內的甲狀腺癌分期指標及預后評估方法的預測效果欠佳[1-3]。因此,臨床上迫切需要尋找新的分子生物標志物,用于PTC患者預后風險評估,推進PTC患者的個體化治療和預后管理。

作為腫瘤相關研究熱點之一的長鏈非編碼RNA (lncRNA) 廣泛存在于真核生物的各個組織器官中,參與分化過程中基因的動態表達,在表觀遺傳、轉錄及轉錄后階段參與調控[4]。LINC00900是一種lncRNA,據報道,LINC00900在膠質瘤、前列腺癌、食管癌等多種癌癥中異常表達,其表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移相關并影響預后,此外LINC00900還在腫瘤細胞中調節基因的表達,進一步影響腫瘤相關信號通路的活化[5-10]。然而,關于LINC00900在PTC中的具體作用和相互聯系,目前研究甚少。故本研究利用美國癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫,研究LINC00900在PTC中的表達及對預后生存的影響,了解其調控網格,同時為研究其在影響相關腫瘤進展和預后方面提供新的見解。現報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料獲取 從TCGA數據庫(https：//cancergenome.nih.gov/)下載PTC的表達譜數據及每個病例相匹配的臨床數據,共獲得498例PTC患者,其中包含58對配對的PTC癌組織及癌旁正常甲狀腺組織標本;<55歲332例,≥55歲166例;女364例,男134例;腫瘤最大徑<4 cm 124例,≥4 cm 275例,未知大小99例;遠處轉移15例,未轉移483例;病理分期：Ⅰ～Ⅱ期333例,Ⅲ～Ⅳ期165例;組織學類型：經典型355例,濾泡型101例,高細胞亞型35例,其他7例;出現新生腫瘤44例,未出現454例;有腫瘤殘余50例,無殘余437例,未知11例;遠處淋巴結轉移20例,無遠處淋巴結轉移478例;臨床病理分期中N分期：N0期225例,N1期58例,N1a期90例,N1b期75例,Nx期50例;M分期：M0期279例,M1期10例,Mx期209例;T分期：T1期43例,T1a期19例,T1b期80例,T2期163例,T3期168例,T4期9例,T4a期14例,Tx期2例。

1.2LINC00900表達水平與臨床病理特征相關性分析 按LINC00900表達水平的中位數,將PTC患者分成高表達組和低表達組,每組249例。采用卡方檢驗分析LINC00900表達與臨床特征的關系。

1.3LINC00900表達對生存率的影響 498例PTC患者均隨訪5年。使用R語言的survival軟件包進行生存分析,評估LINC00900表達對PTC患者生存率的影響。

1.4與LINC00900表達相關的蛋白編碼基因(PCGs)的基因功能富集分析 通過加權基因共表達網絡分析(WGCNA)預測與LINC00900相關的PCGs,選擇相關系數(r)>0.5、P<0.05的PCGs進行基因注釋。利用注釋、可視化和集成發現數據庫(DAVID)在線注釋工具對篩選出的PCGs進行基因本體論(GO)分析和KEGG通路分析。筆者選擇了以下注釋：生物過程、細胞組分、分子功能和KEGG通路。

2 結 果

2.1LINC00900表達水平分析 58對配對的PTC癌組織及癌旁正常甲狀腺組織的檢測結果顯示,LINC00900在PTC癌組織中的表達水平(3.21±2.28)顯著高于癌旁正常甲狀腺組織(1.73±0.72),差異有統計學意義(P<0.001),見圖1A。498例PTC癌組織和58例癌旁正常甲狀腺組織的檢測結果顯示,LINC00900在PTC癌組織中的表達水平(3.49±2.21)顯著高于癌旁正常甲狀腺組織(1.73±0.72),差異有統計學意義(P<0.001),見圖1B。

注：A為58例配對的PTC癌組織及癌旁正常甲狀腺組織中LINC00900的表達;B為498例PTC癌組織和58例癌旁正常甲狀腺組織中LINC00900的表達;*P<0.001。

2.2LINC00900表達水平不同臨床病理特征LINC00900表達水平比較 TCGA數據集分析結果顯示,不同年齡、病理T分期、組織學類型的PTC患者LINC00900表達水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征的PTC患者LINC00900水平比較

2.3不同年齡PTC患者的LINC00900表達水平比較 ≥55歲PTC患者的LINC00900表達水平(3.18±2.13)明顯低于<55歲患者(3.64±2.23),差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：*P<0.001。

2.4不同病理T分期PTC患者LINC00900表達水平比較 T分期中,T3～T4期PTC患者的LINC00900表達水平(3.12±2.23)明顯低于T1～T2期患者(4.21±2.35),差異有統計學意義(P<0.001)。見圖3。

注：*P<0.001。

2.5不同組織學類型PTC患者LINC00900表達水平比較 高細胞亞型PTC患者LINC00900表達水平低于經典型、濾泡型和其他型,差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 LINC00900在PTC的不同病理亞型中差異表達

2.6LINC00900表達與PTC患者生存率的關系 隨訪5年,498例PTC患者中死亡16例,生存482例,總生存率(OS)為96.79%。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示,LINC00900高表達PTC患者的OS[98.80%(246/249)]高于LINC00900低表達患者[90.76%(13/249)],差異有統計學意義(Log-rankχ2=6.691,P<0.05)。見圖5。

圖5 不同LINC00900表達水平的PTC患者生存曲線的比較

2.7與LINC00900表達相關的PCGs的功能富集分析 功能富集分析結果顯示,在核小體裝配、mRNA的剪接、組蛋白H3甲基化的修飾、染色體綁定、組蛋白乙酰轉移酶調節因子活性調節、鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶活性調節、黏蛋白型O-聚糖生物合成等途徑在相關的PCGs出現不同程度的富集。見圖6。

圖6 與LINC00900表達相關的基因的功能富集分析結果

3 討 論

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤,其中最常見的病理類型是PTC,近年來PTC發病率迅速上升。絕大部分PTC預后良好,但仍有一小部分顯示出難治性或者出現轉移和復發。因此,當下研究的熱點應該是如何對PTC患者進行風險分層及預后評估。據報道,lncRNA可經過調節腫瘤血管內皮細胞的生成、增殖等影響腫瘤的發生及發展[5]。lncRNA在甲狀腺癌組織癌旁正常組織以及腫瘤不同進展階段的差異性表達研究有助于甲狀腺癌的診斷和預后預測。部分表達差異的lncRNA與PTC患者臨床病理特征之間存在一定的相關性。研究顯示,在甲狀腺癌中lncRNA可通過促進或者抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、腫瘤細胞的自噬、凋亡及上皮間充質轉化(EMT)等途徑調控甲狀腺癌的進展[6]。

LIU等[7]研究報道,LINC00900在多種人類惡性腫瘤中異常表達,并與預后相關,且LINC00900作為Toll樣受體(TLR)相關的lncRNA,是食管癌的風險因子。在膠質瘤中LINC00900是EMT和N6-甲基腺苷甲基化(m6A)及壞死相關的lncRNA,其表達水平隨腫瘤分級的增加而升高,與腫瘤的惡性程度呈正相關,對膠質瘤具有良好的預后評估價值[8-10]。然而,在前列腺癌中,LINC00900在癌組織中高表達,生存分析顯示高表達患者生存率較高,是前列腺癌的保護性因子[11]。在甲狀腺癌中,LINC00900也被報道是自噬相關的lncRNA,被篩選出作為判斷預后的指標之一[12-16]。因此筆者推斷LINC00900在腫瘤中的作用可能是雙重的,既可作為抑癌因子也可成為促癌因子,這取決于特定的組織及癌癥進展的特定階段。影響甲狀腺癌預后主要因素有病理組織學類型、腫瘤大小、是否淋巴結轉移、是否遠處轉移、癌基因、年齡、性別、治療相關因素、腫瘤分期等[17-18]。患者年齡一直是PTC臨床分期和評估預后的重要指標之一。相對于<55歲的患者,≥55歲的PTC患者腫瘤侵襲性增強、腫瘤增大及腫瘤切除不完整等風險增加,且生存時間更短[19-20]。本研究結果顯示,LINC00900在PTC癌組織中的表達水平高于癌旁正常甲狀腺組織(P<0.05);TCGA數據集分析結果顯示,不同年齡、病理T分期、組織學類型的PTC患者LINC00900表達水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05),而這些臨床特征均是影響PTC預后的關鍵因素,提示LINC00900表達水平可作為判斷PTC預后的指標之一。

本研究結果顯示,≥55歲的PTC患者LINC00900表達水平明顯低于<55歲患者(P<0.01),病理分期T3～T4期PTC患者的LINC00900表達水平明顯低于T1～T2期(P<0.001);高細胞亞型PTC患者LINC00900表達水平低于經典型、濾泡型和其他型(P<0.01)。據研究報道,高年齡和高病理T分期的PTC患者預后相對于低年齡組和低T分期的患者較差,高細胞亞型PTC相對于另外經典型和濾泡型PTC具有更強的侵襲性和較高的淋巴結轉移率、復發率,患者預后相對較差[21-23]。這與本研究結果一致。本研究生存分析結果顯示,LINC00900高表達組PTC患者的生存率明顯長于低表達組。以上結果均提示LINC00900可能是PTC患者的保護性預后相關因子。

為了進一步探討LINC00900在PTC發生、發展中的可能機制,基于LINC00900的表達數據,對與其表達相關的蛋白編碼基因進行功能富集分析。GO分析顯示,相關的PCGs參與的生物進程主要包括核小體裝配、進行mRNA的剪接、組蛋白H3甲基化的修飾、鞘氨醇代謝、鐵-硫簇轉移的蛋白質成熟、去磷酸化等;執行的分子功能主要包括調節蛋白結合,組蛋白結合及染色體綁定,組蛋白乙酰轉移酶調節因子活性調節,鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶活性調節;參與了細胞核中染色質、剪接體等細胞組分。KEGG通路分析顯示,相關的PCGs富集在黏蛋白型O-聚糖生物合成通路。其中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是高等生物中高度保守的活性鞘脂類代謝物,調節多種細胞過程,S1P信號異常會導致包括癌癥在內的多種疾病發生[24]。組蛋白修飾失衡可導致腫瘤發生、發展,且組蛋白H3甲基化的喪失已被證實是腫瘤細胞的標志物[25]。在腫瘤中常伴隨著黏蛋白型O-聚糖結構和數量上的改變,形成腫瘤特異聚糖結構。腫瘤特異聚糖使腫瘤細胞的抗原性和黏附能力發生改變,促進腫瘤細胞的惡性增生與轉移[26]。而目前對于以上通路在PTC中的表達研究甚少,故本研究的基因功能富集結果提示LINC00900可能通過以上通路介導腫瘤的發生、發展,并影響預后,為進一步探索LINC00900影響PTC預后的可能機制提供新的線索。

綜上所述,LINC00900表達水平與PTC患者年齡、病理學T分期、組織學類型有關。在PTC中,LINC00900高表達是一種預后保護因素,可作為輔助判斷PTC預后的有效生物標志物之一。