亞葉酸鈣合成工藝研究

楊藏軍

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

亞葉酸鈣又名5- 甲酰基四氫葉酸鈣，別名安曲希，是一種類白色至微黃色結(jié)晶或無定形粉末；在水中溶解，在乙醇和乙醚中幾乎不溶。在醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛。作為四氫葉酸的甲酰衍生物，亞葉酸鈣與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制DNA 的合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用；用作葉酸拮抗劑（如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧芐啶等） 的解毒劑；用于預(yù)防甲氨蝶呤過量或大劑量治療后所引起的嚴重毒性作用；此外還可用于由葉酸缺乏引起的巨幼紅細胞性貧血。

傳統(tǒng)的亞葉酸鈣制備工藝是將葉酸溶解于堿性溶液中，以硝酸鉛作為催化劑進行還原，所得還原產(chǎn)物經(jīng)甲酰化反應(yīng)成環(huán)后酸化得到甲酰四氫葉酸鹽酸鹽，最后再與水溶性鈣鹽水解反應(yīng)得到亞葉酸鈣。整個制備過程均用二巰基乙醇作為抗氧化保護劑。此方法中所用硝酸鉛催化劑、二巰基乙醇抗氧化保護劑均具有毒性，若在亞葉酸鈣中殘存，將帶來質(zhì)量安全隱患。

針對傳統(tǒng)亞葉酸鈣制備合成工藝存在的缺點，對其合成工藝路線進行優(yōu)化。以葉酸為原料，硼氫化鈉作為催化劑進行還原得到四氫葉酸，再經(jīng)過甲酰化環(huán)合酸化成鹽，最后在鈣鹽中水解成鹽得到亞葉酸鈣。

該工藝合成亞葉酸鈣，起始原料及試劑易得，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，合成過程中毒性小，安全性能好，“三廢”處理簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 主要實驗儀器與試劑

1.1 主要實驗儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜（賽默飛世爾科技（中國） 有限公司），默克密理博Milli-Q IQ 7000 水純化機（密理博中國有限公司），BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司），KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DF-101T 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海耀裕儀器設(shè)備有限公司）、電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 主要實驗試劑

葉酸（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司）；硼氫化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）三氟乙酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氯化鈣（天津市大茂化學(xué)試劑廠），以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 四氫葉酸的制備

2.1.1 葉酸還原為四氫葉酸方程式

葉酸還原為四氫葉酸方程式如圖1 所示。

圖1 四氫葉酸合成方程式Fig.1 Tetrahydrofolate synthesis by Eq

2.1.2 影響反應(yīng)的因素

本實驗主要考察了還原劑用量、反應(yīng)時間、淬滅溫度等因素對四氫葉酸純度的影響，通過單因素實驗，得到較優(yōu)的四氫葉酸生產(chǎn)工藝條件。

（1） 還原劑用量對四氫葉酸純度的影響。

將18 g30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60℃，使葉酸溶解，將不同用量的NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應(yīng)2 h，考察不同硼氫化鈉用量對四氫葉酸純度的影響，實驗結(jié)果見表1。

表1 硼氫化鈉用量對四氫葉酸純度影響Table 1 Effect of the dosage of sodium borohydride on the purity of tetrahydrofolate

硼氫化鈉用量較少時，葉酸反應(yīng)不完全，硼氫化鈉用量較多時，葉酸反應(yīng)完全，但副產(chǎn)也增多，四氫葉酸純度不高，所以最佳質(zhì)量比為葉酸∶硼氫化鈉=1∶0.8。

（2） 反應(yīng)時間對四氫葉酸純度的影響。

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應(yīng)2、3、4 h，考察不同反應(yīng)時間對四氫葉酸純度的影響。實驗結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)時間對四氫葉酸純度影響Table 2 Effect of reaction time on the purity of tetrahydrofolate

由表2 可得，隨著反應(yīng)時間的增長，四氫葉酸的純度下降，雜質(zhì)增多，這是因為四氫葉酸不穩(wěn)定，在高溫條件下易被氧化或降解生成蝶呤類雜質(zhì)及對氨基苯甲酰谷氨酸。因此，高溫還原時間最佳為2 h。

（3） 淬滅溫度對四氫葉酸純度的影響。

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，冷卻降不同溫度，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為3 ～4，考察四氫葉酸純度，實驗結(jié)果見表3。

表3 淬滅溫度對四氫葉酸純度的影響Table 3 Effect of the quenching temperature on the purity of tetrahydrofolate

不同的淬滅溫度對四氫葉酸影響較大，是因為四氫葉酸不穩(wěn)定，溫度較高時，極易變色變質(zhì)，查閱資料，四氫葉酸于-20 ℃儲存，所以，調(diào)節(jié)pH值時，必須在低溫下（0～5 ℃） 進行，以保證四氫葉酸的穩(wěn)定性。

2.1.3 還原反應(yīng)小結(jié)

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入1 000 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g 的NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應(yīng)2 h，降溫至0 ～5 ℃，用濃鹽酸調(diào)pH 值為3 ～4，析出四氫葉酸晶體，攪拌0.5 h，抽濾，得四氫葉酸濕品，將四氫葉酸濕品放入冰箱-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽

2.2.1 四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽反應(yīng)方程式

5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽合成方程式如圖2 所示。

圖2 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽合成方程式Fig.2 An equation for the synthesis of 5,10-methylene tetrahydrofolate hydrochloride

2.2.2 影響反應(yīng)的因素

第二步甲酰化反應(yīng)主要考察了反應(yīng)溫度對5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽純度的影響。

（1） 反應(yīng)溫度對甲酰化反應(yīng)的影響

向四口瓶中加入四氫葉酸，甲酸，三氟乙酸，開啟攪拌和加熱，于不同溫度下反應(yīng)6 h，取樣進行液相分析，實驗結(jié)果見表4。

表4 反應(yīng)溫度對5,10- 亞甲基四氫葉酸純度的影響Table 4 Effects of reaction temperature on the purity of 5,10-methylene tetrahydrofolate

由表4 可見，四氫葉酸甲酰化反應(yīng)隨著溫度的升高，5,10- 亞甲基四氫葉酸純度有所下降，副反應(yīng)增加。所以該反應(yīng)最佳反應(yīng)溫度為30 ℃。

2.2.3 甲酰化成鹽反應(yīng)工藝總結(jié)

四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽最佳工藝條件為四氫葉酸、甲酸與三氟乙酸、濃鹽酸按1∶3.75∶0.375∶3.75 的質(zhì)量比進行投料。將第一步所得四氫葉酸投至四口瓶中，依次加入甲酸、三氟乙酸攪拌溶解后升溫至30 ℃，恒溫反應(yīng)6 h，反應(yīng)完畢，減壓蒸除甲酸，將所得濃縮液投至四口瓶中，加入濃鹽酸在室溫下攪拌2 h成鹽，抽濾得5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽。

2.3 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽合成亞葉酸鈣

2.3.1 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽合成亞葉酸鈣反應(yīng)方程式

亞葉酸鈣合成方程式如圖3 所示。

圖3 亞葉酸鈣合成方程式Fig.3 The leucovorin calcium synthesis equation

2.3.2 影響反應(yīng)的因素

水解反應(yīng)考察了水解pH 值、水解溫度、水解時間3 個因素對亞葉酸鈣純度的影響。

（1） 水解液pH 值對亞葉酸純度的影響。

開環(huán)步驟中，由于5，10- 亞甲基四氫葉酸在堿性條件下易生成10- 甲酰四氫葉酸（動力學(xué)控制的過程），在生產(chǎn)規(guī)模下以強堿溶液調(diào)節(jié)開環(huán)體系的pH 值，極易造成局部pH 值過高，生成10 位甲酰化的副產(chǎn)物，由于該類雜質(zhì)溶解度低于亞葉酸鈣，拆分過程常常隨著析出主產(chǎn)物一起析出，難以去除，實驗結(jié)果見表5。

表5 水解pH 值對亞葉酸純度的影響Table 5 Effect of hydrolysis of pH vaule on leucovorin purity

由表5 可得，水解過程必須嚴格控制水解液pH 值為6 ～7，若水解液堿性增大為pH 值為9 ～10，那么開環(huán)反應(yīng)生成的10- 甲酰基四氫葉酸雜質(zhì)較多。

（2） 水解溫度對亞葉酸純度的影響。

水解pH 值保持在6～7 之間不變，水解時間為3、4 h，考察水解溫度為70、80、90、100 ℃對亞葉酸純度的影響，實驗結(jié)果見表6。

表6 水解溫度對亞葉酸純度的影響Table 6 Effect of the hydrolysis temperature on the purity of leucovorate

由表6 可得，5,10- 亞甲基四氫葉酸水解成亞葉酸的最佳水解溫度為100 ℃，此時亞葉酸的純度最高。

（3） 水解時間對亞葉酸純度的影響。

水解液pH 值保持在6 ～7 之間不變，水解溫度為100 ℃，考察水解時間為1、2、3、4、6、7 h對亞葉酸純度的影響，實驗結(jié)果見表7。

表7 水解時間對亞葉酸純度的影響Table 7 Effects of hydrolysis time on the purity of leucovorate

由表7 可見，反應(yīng)剛開始，隨著水解時間的增長，5,10- 亞甲基四氫葉酸水解為亞葉酸的純度越高，但超過6 h，繼續(xù)水解時間的增長，亞葉酸的純度反而下降，可能是亞葉酸高溫下不穩(wěn)定，氧化所致，所以最佳水解時間為6 h。

2.3.3 水解成鹽工藝總結(jié)

5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽最佳工藝條件為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽、活性炭、無水氯化鈣、無水乙醇按質(zhì)量比1∶0.05∶0.275∶2 進行投料。具體如下：將5,10 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽投入四口瓶中，用30%氫氧化鈉溶液，調(diào)pH=6 ～7，100 ℃水解6 h，加入定量活性炭脫色30 min，過濾，所得濾液降溫至30 ℃，加入氯化鈣反應(yīng)1 h，過濾，濾液加入定量乙醇析出晶體，攪拌0.5 h，降溫至5 ℃，離心得濕品。30 ℃真空干燥5 h，得亞葉酸鈣。

3 結(jié) 語

以葉酸為起始原料，經(jīng)硼氫化鈉還原得四氫葉酸，以甲酸、三氟乙酸為酰化試劑，進行酰化反應(yīng)后與鹽酸成鹽得5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽，最后經(jīng)水解與氯化鈣成鹽得亞葉酸鈣。整個過程收率為40%，經(jīng)HPLC 檢測，成品純度高達99.68%，單雜0.11%，總雜0.79%。