亞葉酸鈣合成工藝研究

楊藏軍

（河北冀衡藥業股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

亞葉酸鈣又名5- 甲酰基四氫葉酸鈣，別名安曲希，是一種類白色至微黃色結晶或無定形粉末；在水中溶解，在乙醇和乙醚中幾乎不溶。在醫藥工業中應用較為廣泛。作為四氫葉酸的甲酰衍生物，亞葉酸鈣與氟尿嘧啶聯合應用能夠抑制DNA 的合成，從而發揮抗腫瘤作用；用作葉酸拮抗劑（如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧芐啶等） 的解毒劑；用于預防甲氨蝶呤過量或大劑量治療后所引起的嚴重毒性作用；此外還可用于由葉酸缺乏引起的巨幼紅細胞性貧血。

傳統的亞葉酸鈣制備工藝是將葉酸溶解于堿性溶液中，以硝酸鉛作為催化劑進行還原，所得還原產物經甲酰化反應成環后酸化得到甲酰四氫葉酸鹽酸鹽，最后再與水溶性鈣鹽水解反應得到亞葉酸鈣。整個制備過程均用二巰基乙醇作為抗氧化保護劑。此方法中所用硝酸鉛催化劑、二巰基乙醇抗氧化保護劑均具有毒性，若在亞葉酸鈣中殘存，將帶來質量安全隱患。

針對傳統亞葉酸鈣制備合成工藝存在的缺點，對其合成工藝路線進行優化。以葉酸為原料，硼氫化鈉作為催化劑進行還原得到四氫葉酸，再經過甲酰化環合酸化成鹽，最后在鈣鹽中水解成鹽得到亞葉酸鈣。

該工藝合成亞葉酸鈣，起始原料及試劑易得，質量穩定可靠，合成過程中毒性小，安全性能好，“三廢”處理簡單，適合工業化生產。

1 主要實驗儀器與試劑

1.1 主要實驗儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜（賽默飛世爾科技（中國） 有限公司），默克密理博Milli-Q IQ 7000 水純化機（密理博中國有限公司），BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司），KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DF-101T 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海耀裕儀器設備有限公司）、電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 主要實驗試劑

葉酸（河北冀衡藥業股份有限公司）；硼氫化鈉（天津市大茂化學試劑廠）；氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠）；甲酸（天津市大茂化學試劑廠）三氟乙酸（天津市大茂化學試劑廠）；氯化鈣（天津市大茂化學試劑廠），以上試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 四氫葉酸的制備

2.1.1 葉酸還原為四氫葉酸方程式

葉酸還原為四氫葉酸方程式如圖1 所示。

圖1 四氫葉酸合成方程式Fig.1 Tetrahydrofolate synthesis by Eq

2.1.2 影響反應的因素

本實驗主要考察了還原劑用量、反應時間、淬滅溫度等因素對四氫葉酸純度的影響，通過單因素實驗，得到較優的四氫葉酸生產工藝條件。

（1） 還原劑用量對四氫葉酸純度的影響。

將18 g30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60℃，使葉酸溶解，將不同用量的NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應2 h，考察不同硼氫化鈉用量對四氫葉酸純度的影響，實驗結果見表1。

表1 硼氫化鈉用量對四氫葉酸純度影響Table 1 Effect of the dosage of sodium borohydride on the purity of tetrahydrofolate

硼氫化鈉用量較少時，葉酸反應不完全，硼氫化鈉用量較多時，葉酸反應完全，但副產也增多，四氫葉酸純度不高，所以最佳質量比為葉酸∶硼氫化鈉=1∶0.8。

（2） 反應時間對四氫葉酸純度的影響。

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應2、3、4 h，考察不同反應時間對四氫葉酸純度的影響。實驗結果見表2。

表2 反應時間對四氫葉酸純度影響Table 2 Effect of reaction time on the purity of tetrahydrofolate

由表2 可得，隨著反應時間的增長，四氫葉酸的純度下降，雜質增多，這是因為四氫葉酸不穩定，在高溫條件下易被氧化或降解生成蝶呤類雜質及對氨基苯甲酰谷氨酸。因此，高溫還原時間最佳為2 h。

（3） 淬滅溫度對四氫葉酸純度的影響。

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入500 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，冷卻降不同溫度，滴加濃鹽酸調節pH 值為3 ～4，考察四氫葉酸純度，實驗結果見表3。

表3 淬滅溫度對四氫葉酸純度的影響Table 3 Effect of the quenching temperature on the purity of tetrahydrofolate

不同的淬滅溫度對四氫葉酸影響較大，是因為四氫葉酸不穩定，溫度較高時，極易變色變質，查閱資料，四氫葉酸于-20 ℃儲存，所以，調節pH值時，必須在低溫下（0～5 ℃） 進行，以保證四氫葉酸的穩定性。

2.1.3 還原反應小結

將18 g 30%NaOH，30 g 葉酸，100 g 的純化水加入1 000 mL 四口瓶中，加熱到60 ℃，使葉酸溶解，將24 g 的NaBH4加入到50 g 水中溶解，緩慢滴加到葉酸溶液中，溫度控制在60 ～65 ℃。滴加完NaBH4，溫度升至90 ℃，反應2 h，降溫至0 ～5 ℃，用濃鹽酸調pH 值為3 ～4，析出四氫葉酸晶體，攪拌0.5 h，抽濾，得四氫葉酸濕品，將四氫葉酸濕品放入冰箱-18 ℃保存備用。

2.2 四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽

2.2.1 四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽反應方程式

5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽合成方程式如圖2 所示。

圖2 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽合成方程式Fig.2 An equation for the synthesis of 5,10-methylene tetrahydrofolate hydrochloride

2.2.2 影響反應的因素

第二步甲酰化反應主要考察了反應溫度對5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽純度的影響。

（1） 反應溫度對甲酰化反應的影響

向四口瓶中加入四氫葉酸，甲酸，三氟乙酸，開啟攪拌和加熱，于不同溫度下反應6 h，取樣進行液相分析，實驗結果見表4。

表4 反應溫度對5,10- 亞甲基四氫葉酸純度的影響Table 4 Effects of reaction temperature on the purity of 5,10-methylene tetrahydrofolate

由表4 可見，四氫葉酸甲酰化反應隨著溫度的升高，5,10- 亞甲基四氫葉酸純度有所下降，副反應增加。所以該反應最佳反應溫度為30 ℃。

2.2.3 甲酰化成鹽反應工藝總結

四氫葉酸甲酰化成鹽為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽最佳工藝條件為四氫葉酸、甲酸與三氟乙酸、濃鹽酸按1∶3.75∶0.375∶3.75 的質量比進行投料。將第一步所得四氫葉酸投至四口瓶中，依次加入甲酸、三氟乙酸攪拌溶解后升溫至30 ℃，恒溫反應6 h，反應完畢，減壓蒸除甲酸，將所得濃縮液投至四口瓶中，加入濃鹽酸在室溫下攪拌2 h成鹽，抽濾得5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽。

2.3 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽合成亞葉酸鈣

2.3.1 5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽合成亞葉酸鈣反應方程式

亞葉酸鈣合成方程式如圖3 所示。

圖3 亞葉酸鈣合成方程式Fig.3 The leucovorin calcium synthesis equation

2.3.2 影響反應的因素

水解反應考察了水解pH 值、水解溫度、水解時間3 個因素對亞葉酸鈣純度的影響。

（1） 水解液pH 值對亞葉酸純度的影響。

開環步驟中，由于5，10- 亞甲基四氫葉酸在堿性條件下易生成10- 甲酰四氫葉酸（動力學控制的過程），在生產規模下以強堿溶液調節開環體系的pH 值，極易造成局部pH 值過高，生成10 位甲酰化的副產物，由于該類雜質溶解度低于亞葉酸鈣，拆分過程常常隨著析出主產物一起析出，難以去除，實驗結果見表5。

表5 水解pH 值對亞葉酸純度的影響Table 5 Effect of hydrolysis of pH vaule on leucovorin purity

由表5 可得，水解過程必須嚴格控制水解液pH 值為6 ～7，若水解液堿性增大為pH 值為9 ～10，那么開環反應生成的10- 甲酰基四氫葉酸雜質較多。

（2） 水解溫度對亞葉酸純度的影響。

水解pH 值保持在6～7 之間不變，水解時間為3、4 h，考察水解溫度為70、80、90、100 ℃對亞葉酸純度的影響，實驗結果見表6。

表6 水解溫度對亞葉酸純度的影響Table 6 Effect of the hydrolysis temperature on the purity of leucovorate

由表6 可得，5,10- 亞甲基四氫葉酸水解成亞葉酸的最佳水解溫度為100 ℃，此時亞葉酸的純度最高。

（3） 水解時間對亞葉酸純度的影響。

水解液pH 值保持在6 ～7 之間不變，水解溫度為100 ℃，考察水解時間為1、2、3、4、6、7 h對亞葉酸純度的影響，實驗結果見表7。

表7 水解時間對亞葉酸純度的影響Table 7 Effects of hydrolysis time on the purity of leucovorate

由表7 可見，反應剛開始，隨著水解時間的增長，5,10- 亞甲基四氫葉酸水解為亞葉酸的純度越高，但超過6 h，繼續水解時間的增長，亞葉酸的純度反而下降，可能是亞葉酸高溫下不穩定，氧化所致，所以最佳水解時間為6 h。

2.3.3 水解成鹽工藝總結

5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽水解成鹽最佳工藝條件為5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽、活性炭、無水氯化鈣、無水乙醇按質量比1∶0.05∶0.275∶2 進行投料。具體如下：將5,10 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽投入四口瓶中，用30%氫氧化鈉溶液，調pH=6 ～7，100 ℃水解6 h，加入定量活性炭脫色30 min，過濾，所得濾液降溫至30 ℃，加入氯化鈣反應1 h，過濾，濾液加入定量乙醇析出晶體，攪拌0.5 h，降溫至5 ℃，離心得濕品。30 ℃真空干燥5 h，得亞葉酸鈣。

3 結 語

以葉酸為起始原料，經硼氫化鈉還原得四氫葉酸，以甲酸、三氟乙酸為酰化試劑，進行酰化反應后與鹽酸成鹽得5,10- 亞甲基四氫葉酸鹽酸鹽，最后經水解與氯化鈣成鹽得亞葉酸鈣。整個過程收率為40%，經HPLC 檢測，成品純度高達99.68%，單雜0.11%，總雜0.79%。