水中糞大腸菌群的測定- 酶底物法與熒光光度法的比較

張 茵，劉溪南，王 靜，劉 娟

（1.河北省生態環境監測中心，河北 石家莊 050035；2.中國南水北調集團中線有限公司 河北水質監測中心，河北 石家莊 050035；3.石家莊高新技術產業開發區供水排水公司，河北 石家莊 050035）

0 引 言

糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群，44.5 度培養24 h，能產生β- 半乳糖甘酶，分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D 吡喃半乳糖甘生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。糞大腸菌群目前常用檢測方法有：多管發酵法、濾膜法、紙片法和酶底物法。

其中濾膜法主要用于雜質較少的水樣，與多管發酵法相比，檢測相對簡單，也需要進行驗證實驗。

熒光光度法原理：糞大腸菌群與各特性培養基反應，生成疏水熒光產物，釋放出熒光，以此原理來測定水樣中糞大腸菌群菌落數的方法。

目前該方法已在2014 年通過美國環境保護局EPA 標準用于檢測水中糞大腸菌群（40 CFR Part 141），同時在2014 通過美國分析化學家協會AOAC 標準用于檢測水中糞大腸菌群。

本文采用熒光光度法種方法檢測不同梯度濃度的定量微生物質控(NSI-QC)菌株，采用酶底物和熒光光度法種方法檢測石家莊、唐山、溫州等不同地區的不同類型（生活飲用水、水源水、污水、景觀用水） 的樣品，按照數理統計規則進行數據分析，通過比對數據判斷熒光光度法的準確度和兩種方法的相關性。

1 操作步驟

1.1 試劑和器材

糞大腸菌群培養基：Fecal Coliform Agar（簡稱：Tectalert FCA）、100 mL 檢測瓶、定量微生物質控(NSI-QC)菌株、滅菌后的生理食鹽水等耗材、大腸菌群熒光檢測儀購自愛德士公司。定量盤、程控封口機、科立德試劑、100 mL 樣品瓶（均購于愛德士公司）；ZXGP-B2080 隔水式恒溫培養箱（上海智誠分析儀器制造有限公司） 溫控精度為±0.5 ℃。

1.2 試驗步驟

1.2.1 高濃度定量微生物質控(NSI- QC)樣品的制備

定量微生物質控(NSI-QC)菌株從-10 ℃冰箱取出,首先在室溫下平衡溫度10 ～15 min，隨后將質控菌株轉移入預先準備好的100 mL 滅菌后的生理食鹽水中，輕輕振蕩，待全部溶解后，將10 mL樣品加入90 mL 無菌生理食鹽水中作10 倍稀釋，在水合作用30 min 內進行檢測，分別采用酶底物法和熒光光度法測定濃度值。

1.2.2 低濃度定量微生物質控(NSI- QC)質控樣品制備

定量微生物質控(NSI-QC)菌株從-10 ℃冰箱取出，首先在室溫下平衡溫度10 ～15 min，隨后將質控菌株轉移入預先準備好的100 mL 滅菌后的生理食鹽水中，輕輕振蕩，待全部溶解后，稀釋10倍，在水合作用30 min 內進行檢測，分別采用酶底物法和熒光光度法測定濃度值。

1.2.3 實際樣品采集

根據日常檢測的數據分別采集石家莊、唐山、邢臺、江門、溫州等不同地區水源水（地表水）、景觀水、污水等，分別用兩種方法進行測定。

1.2.4 熒光光度法測定水中糞大腸菌群

將100 mL 待測樣品加入在檢測瓶中加入2 g培養基（Tectalert FCA） 放置于大腸菌群熒光檢測儀中，選擇測定糞大腸菌群。根據濃度自動讀取數據（檢測時間2 ～18 h）。

1.2.5 酶底物法測定水中糞大腸菌群

酶底物法檢測步驟參照《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》（HJ1001-2018），培養溫度44.5 ℃，24 h，樣品變為黃色判斷為糞大腸菌群。

2 試驗結果分析

2.1 不同濃度耐熱總大腸定量微生物質控(NSIQC)檢測結果

將不同濃度糞大腸菌群定量微生物質控(NSI-QC)質控樣品用熒光光度法平行檢測6 次。將結果與定量質控的真值范圍進行比較，所有結果均在定量質控的真值范圍內，合格率為100%。

熒光光度法測定中濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果見表1。

表1 熒光光度法測定中濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果Table1 Results of quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples in fluorometric determination

熒光光度法測定低濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果見表2。

表2 熒光光度法測定低濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果Table 2 The results of lowconcentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry

熒光光度法測定高濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果見表3。

表3 熒光光度法測定高濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品的檢測結果Table 3 The results of high concentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry

由不同梯度的質控濃度測定結果可以得出結論，熒光光度法測定糞大腸菌群的結果在質控范圍內，準確度滿足相關要求。

2.2 實際樣品及加標水樣檢測結果方法比對分析

分別從全國不同地區選擇水源水（地表水）、景觀水、污水等及滅菌水，用熒光光度法和酶底物法同時對樣品進行檢測。為進一步探究兩種方法在檢測樣品 時是否存在差異性運用軟件SPSS Statistics 軟件對濾膜法和光度法的檢測結果進行t檢驗分析,為了使檢測結果呈正態分布，將檢測結果作對數處理后再進行t 檢驗分析，結果如表5 所示。通過對數據進行統計分析，說明熒光光度法與酶底物法具有高度一致性。

水源水數據分析（地表水） 見表4。

表4 水源水數據分析（地表水）Table 4 Source water data analysis(surface water)

景觀水數據分析見表5。

表5 景觀水數據分析Table 5 Analysis of landscape water data

污水數據分析見表6。

表6 污水數據分析Table 6 Sewage data analysis

2.3 數據處理

對表4 ～6 數據酶底物法和熒光光度法檢測結果進行配對T 檢驗，為了使數據呈正態分布，對數據進行對數處理后再進行配對T 檢驗。由以上數據可知樣品測定值經過計算，P=0.078＞0.05，說明酶底物法和熒光光度法的結果無顯著性差異，具有統計學意義。

配對樣本檢驗結果見表7。

表7 配對樣本檢驗結果Table 7 Results of paired samples

2.4 無菌環境與有菌環境檢測結果

取滅菌后的生理食鹽水14 組，用熒光光度法在無菌環境和有菌環境中進行測定，測定結果均為陰性。實驗結果見表8。

表8 無菌環境下熒光光度法測定滅菌后的生理食鹽水結果Table 8 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment

有菌環境下熒光光度法測定滅菌后的生理食鹽水結果見表9。

表9 有菌環境下熒光光度法測定滅菌后的生理食鹽水結果Table 9 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment

3 討 論

3.1 定量微生物質控(NSI-QC)樣品檢測結果分析

通過分別采用熒光光度法和酶底物法對高、中、低不同濃度的NSI 糞大腸菌群定量質控樣品檢測結果分析，二者相差不大，具有等效性。

3.2 實際樣品及陰性樣品檢測

對水源水（地表水）、景觀水、污水等樣品進行檢測后，對數據進行統計分析，t 檢驗結果為P=0.078（＞0.05），說明酶底物法和熒光光度法的檢測結果無統計學差異，均可有效檢測水中糞大腸菌群數。

熒光光度法檢測無菌生理食鹽水無菌環境和有菌環境下下，檢測結果均為陰性，說明熒光光度法無需在專業無菌室環境操作，節省了實驗室建設成本的同時也滿足了應急檢測的需求。

3.3 熒光光度法優缺點

（1） 熒光熒光光度法測定數據時間較短（2 ～18 h 即可得出檢測結果）

（2） 熒光光度法可以自動計數，規避了由于酶底物觀察時間不同、對結果測定結果判斷誤差引起的讀數偏差。

（3） 熒光光度法測定范圍范圍廣，最高108·100 mL-1。

酶底物法和熒光光度法優缺點比較見表10。

表10 酶底物法和熒光光度法優缺點比較Table 10 Compare the advantages and disadvantages of enzyme substrate method and fluorescence method

4 結 論

（1） 熒光光度法測定不同梯度濃度定量微生物質控(NSI-QC)樣品，測定結果均在不確定度范圍內，說明該方法的準確度滿足測定要求。

（2） 2 種方法檢測結果無明顯差距，具有等效性。

（3） 熒光光度法測定范圍廣（最高可測定108 CFU/100 mL）。

（4） 自動讀取實驗數據，規避了由于讀取時間不同對測定結果的影響，更適合實驗室日常檢測和應急檢測。