差異表達基因CDCA8、CDC20與腎母細胞瘤患者預后及免疫細胞浸潤的關系

楊迪，黃業華，黃和松，蒙菲，黃靚，岑琴，覃花杏，張東虎

摘要：目的? 探討差異表達基因CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤中的表達，以及與腎母細胞瘤患者預后及免疫細胞浸潤的關系。方法? 登錄并下載GEO數據庫及Target數據庫中與腎母細胞瘤相關的基因表達譜數據；利用R語言篩選出差異表達基因，篩選出與腎母細胞瘤預后有關的基因；利用R語言中的CIBERSORT計算方法計算出腎母細胞瘤中免疫細胞浸潤的表達；利用SPSS分析腎母細胞瘤預后有關的基因與免疫細胞浸潤的相關性。結果? GEO表達譜數據GSE66405、GSE73209、GSE11151篩選出共同差異表達基因1260個，其中高表達398個，低表達862個；蛋白互作網絡篩選出15個核心蛋白，包括CDK1、CCNA2 、TOP2A、CCNB2、KIF11、BUB1、BUB1B、ASPM、NUSAP1、CDC20、CDCA8、KIF20A、DLGAP5、TPX2、CENPF，其中CDCA8及CDC20與腎母細胞瘤患者預后有關；T cells CD4 memory activated（P=0.026）、T cells follicular helper（P=0.031）、Macrophages M0（P=0.005）、Dendritic cells activated（P=0.025）的表達高于正常對照組，而Plasma cells（P=0.023）、T cells CD4 memory resting（P=0.002）、NK cells resting（P=0.045）、Monocytes（P=0.013）在腎母細胞瘤中低表達。相關性分析顯示，CDCA8與6個免疫細胞浸潤具有相關性，CDC20與5個免疫細胞浸潤具有相關性。結論? CDCA8及CDC20有可能成為腎母細胞瘤患者治療的新潛在靶點。

關鍵詞：腎母細胞瘤；CDCA8；CDC20；免疫細胞浸潤

中圖分類號：R737.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.08.001

文章編號：1006-1959（2024）08-0001-09

Relationship Between Differentially Expressed Genes CDCA8， CDC20 and Prognosis，

Immune Cell Infiltration in Patients with Nephroblastoma

YANG Di1，HUANG Ye-hua2，HUANG He-song3，MENG Fei1，HUANG Liang1，CEN Qin4，QIN Hua-xing4，ZHANG Dong-hu1

（1.Department of Pediatric Surgery，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China;

2.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China;

3.Department of Respiratory Intensive Care，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，

Baise 533000，Guangxi，China;

4.Department of General Surgery，Baidong Hospital of Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

Abstract：Objective? To investigate the expression of differentially expressed genes CDCA8 and CDC20 in nephroblastoma and their relationship with prognosis and immune cell infiltration in patients with nephroblastoma.Methods? The gene expression profile data related to nephroblastoma in GEO database and Target database were logged in and downloaded. The differentially expressed genes were screened by R language， and the genes related to the prognosis of nephroblastoma were screened. The expression of immune cell infiltration in nephroblastoma was calculated by CIBERSORT calculation method in R language. SPSS was used to analyze the correlation between genes related to the prognosis of nephroblastoma and immune cell infiltration.Results? A total of 1260 common differentially expressed genes were screened out from GEO expression profile data GSE66405， GSE73209 and GSE11151， of which 398 were highly expressed and 862 were lowly expressed. The protein interaction network screened 15 core proteins， including CDK1， CCNA2， TOP2 A， CCNB2， KIF11， BUB1， BUB1B， ASPM， NUSAP1， CDC20， CDCA8， KIF20 A， DLGAP5， TPX2， CENPF， among which CDCA8 and CDC20 were related to the prognosis of nephroblastoma patients. The expression of T cells CD4 memory activated （P=0.026）， T cells follicular helper （P=0.031）， Macrophages M0 （P=0.005） and Dendritic cells activated （P=0.025） in nephroblastoma was higher than that in normal control group. Plasma cells （P=0.023）， T cells CD4 memory resting （P=0.002）， NK cells resting （P=0.045） and Monocytes （P=0.013） were lowly expressed in nephroblastoma. Correlation analysis showed that CDCA8 was correlated with 6 immune cell infiltration， while CDC20 was correlated with 5 immune cell infiltration.Conclusion? CDCA8 and CDC20 may be new potential targets for the treatment of patients with nephroblastoma.

Key words：Nephroblastoma;CDCA8;CDC20;Immune cell infiltration

腎母細胞瘤（nephroblastoma）是兒童第二大最常見的腹內癌癥，也是兒童第五大最常見的惡性腫瘤[1，2]。在兒童中，有95%以上的腎臟腫瘤是腎母細胞瘤，在2～3歲時腎母細胞瘤的發病率達到高峰[3]。隨著手術、化療、放療的聯合治療，腎母細胞瘤的遠期生存率由過去的30%提高到了90%以上，然而復發率仍然保持在15%～50%[1，2，4]。由此可見，腎母細胞瘤的治療仍然有必要進一步提高，探索新的治療腎母細胞瘤的靶點及方法具有一定的臨床意義。人類細胞分裂周期相關基因8（cell division cycle associated 8， CDCA8）是人類細胞分裂周期相關基因家族中一個重要成員，是細胞有絲分裂周期調節基因，參與多種腫瘤細胞的增殖進程。研究發現[5]，CDCA8基因在肝癌中高表達，且Kaplan-Meier生存分析中發現，高表達的CDCA8與肝癌低預后相關。在膀胱癌中，敲除CDCA8可抑制膀胱癌細胞的增殖并且促進其細胞凋亡[6]。研究發現[7]，miR-133a-3p能夠靶向調控CDCA8的表達，從而影響食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，進一步影響食管癌的進展。在肺腺癌的研究中[8]，miR-133b可靶向調控CDCA8的表達從而抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲。細胞周期蛋白20（cell-division cycle protein 20， CDC20）是紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint， SAC）的靶標，在有絲分裂中發揮重要作用。Zhang X[9]研究發現，CDC20在乳腺癌中高表達，并且高表達的CDC20提示乳腺癌患者較差的總生存時間。另有研究發現[10]，在人胰腺癌細胞中CDC20呈高表達，沉默CDC20可以提高放射治療對胰腺癌細胞的敏感性。在結直腸癌中，通過下調CDC20可通過調控Mcl-1/p-Chk1介導結直腸癌細胞的DNA損傷及細胞凋亡，進而增加結直腸癌細胞的放射敏感性[11]。目前關于CDCA8及CDC20基因在腎母細胞瘤中表達情況報道較少，本研究通過篩選出差異基因并分析CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤中的表達情況，探討CDCA8及CDC20與腎母細胞瘤患者總生存時間的關系，分析CDCA8及CDC20與腎母細胞瘤免疫細胞浸潤的相關性，為尋找腎母細胞瘤新治療靶點提供一定的理論基礎。

1資料與方法

1.1數據來源及基本信息? 登錄美國國立生物信息技術中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）建立的GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫官網（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term=），以“wilms tumor”為關鍵詞搜索并篩選與腎母細胞瘤相關的基因表達譜數據。登錄兒童腫瘤數據庫Target數據庫（https：//www.cancer.gov/ccg/）下載與腎母細胞瘤相關mRNA表達譜數據。其中，Target數據庫中包含130例腫瘤患者以及6例對應正常癌旁組織，130例腎母細胞瘤患者均包含了相關的臨床資料及生存資料。

1.2差異表達基因的篩選? 利用R語言中的limma包以logFCfilter=1及adj.P.Val.Filter=0.05為標準，分別篩選GEO表達譜數據GSE66405、GSE73209、GSE11151中的差異表達基因，并繪制出差異表達基因熱圖及火山圖。在分別得到3個GEO表達譜數據的差異表達基因后，利用R語言中的RobustRankAggreg包篩選出3組差異表達基因的共同差異表達基因，并利用R語言中的pheatmap包繪制出共同差異表達基因的熱圖。

1.3共同差異表達基因的KEGG通路分析及GO富集分析? 在得到3組GEO表達譜數據的共同差異表達基因后，利用R語言中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包分別計算出共同差異表達基因的KEGG通路分析及GO富集分析。

1.4蛋白互作網絡的構建及核心蛋白的篩選? 登錄蛋白互作網絡官網（https：//string-db.org/），輸入差異表達基因，在minimum required interaction score選擇highest confidence（0.900），得到蛋白互作網絡的結果，選擇下載string_hires_image.png圖片和string_interactions.tsv文件，文件繼續用于下一步分析。將上述蛋白互作網絡結果的string_interactions.tsv文件導入Cytoscape3.7.2軟件。利用Cytoscape軟件中的CytoHubba工具篩選出核心蛋白。

1.5 CDCA8及CDC20基因在腎母細胞瘤中的表達及與預后的關系? Target數據庫中的數據包含有腎母細胞瘤患者的生存時間，利用R語言中的limma包及beeswarm包分別分析CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤與正常組織中表達的差異。利用R語言中的survival包分別分析CDCA8基因及CDC20基因表達量與腎母細胞瘤患者總生存時間的關系。

1.6免疫細胞浸潤在腎母細胞瘤中的表達? 登錄CIBERSORT官網下載22種免疫細胞的CIBERSPRT.R代碼，運用R語言中e1071包及preprocessCore數據包進行運算，最終得到22種免疫細胞在每例樣品中的表達情況。運用R語言，繪制出22種免疫細胞在每例樣品表達百分比以及免疫細胞浸潤表達的熱圖；在R語言中下載vioplot包，分析免疫細胞浸潤在腎母細胞瘤及正常組織中差異表達，繪制出小提琴圖。

1.7 CDCA8、CDC20與免疫細胞浸潤的關系? 在得到免疫細胞浸潤在腎母細胞瘤中的表達量后，將CDCA8、CDC20及22種免疫細胞浸潤的表達結果導入SPSS 23.0，點擊SPSS軟件，選擇欄目中的分析，點擊雙變量相關分析，統計學方法選擇Spearman統計學方法分別分析CDCA8與22種免疫細胞浸潤的關系以及CDC20與22種免疫細胞浸潤的關系。

1.8統計學方法? 本研究運用R語言（4.0.2）內的多個統計數據包將數據導入R軟件并進行統計學分析及結果圖片繪制。差異基因的篩選是利用R語言limma包，以logFCfilter=1及adj.P.Val.Filter=0.05為標準。共同差異表達基因的篩選利用R語言的RobustRankAggreg包篩選，P＜0.05納入共同差異表達基因。KEGG及GO富集分析利用R語言中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包，P＜0.05認為被納入的條件。核心蛋白的篩選利用Cytoscape3.7.2軟件中的CytoHubba工具，選擇MCC計算方法。免疫細胞浸潤的計算是利用22種免疫細胞浸潤的基因CIBERSPRT.R代碼，運用R語言中e1071包及preprocessCore數據包進行運算。其他計量資料運用t檢驗，計數資料運用？字2檢驗或秩和檢驗，CDCA8及CDC20基因的生存分析在R語言中采用Kaplan-Meier法Log-rank檢驗，CDCA8、CDC20基因與免疫細胞浸潤的相關性分析在SPSS 23.0中采用Spearman統計學方法，對于所有統計學計算，最終結果以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1差異表達基因的篩選? 在GEO數據庫中收集GSE66405、GSE73209、GSE11151表達譜數據，GSE66405包含腎母細胞瘤組織28例，正常組織4例；GSE73209包含腫瘤組織32例，正常組織6例；GSE11151表達譜數據包含4例腫瘤組織及5例正常組織。在Target數據庫中收集到130例腎母細胞瘤，另有6例正常對照組。在GSE66405表達譜數據中篩選出2349個差異表達基因，包括上調差異表達基因745個，下調差異表達基因1604個。在GSE73209表達譜數據中，篩選出508個差異表達基因，其中54個高表達差異表達基因，454個低表達差異表達基因。在GSE11151表達譜數據中，篩選出684個差異表達基因，其中166高表達，518個低表達。利用R語言limm包，最終在3組GEO表達譜數據的差異表達基因中篩選出1260個共同差異表達基因，其中高表達398個，低表達862個。利用R語言繪制出差異表達基因的熱圖及火山圖，見圖1、圖2。

2.2共同差異表達基因的KEGG基因通路分析及GO基因富集分析? 在得到1260個共同差異表達基因后，利用R語言中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包分析1260個共同差異表達基因的KEGG通路分析及GO富集分析，其中GO富集分析包含BP、CC、MF共3部分，利用R語言繪制出前30個KEGG基因通路及GO富集分析結果，見圖3。

2.3蛋白互作網絡的構建及核心蛋白的篩選? 將1260個共同差異表達基因導入String網頁中，在minimum required interaction score選擇highest confidence（0.900），最終構建出共同差異表達基因的蛋白互作網絡，見圖4。利用Cytoscape3.7.2軟件中的CytoHubba工具，選擇MCC計算方法篩選出15個核心蛋白，包括CDK1、CCNA2、TOP2A、CCNB2、KIF11、BUB1、BUB1B、ASPM、NUSAP1、CDC20、CDCA8、KIF20A、DLGAP5、TPX2、CENPF，見圖5。

2.4 CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤中的表達及與總生存時間的關系? 得到15個核心蛋白后，利用Target數據庫分析核心蛋白在腎母細胞瘤中的表達以及與總生存時間的關系，最終得到CDCA8在腎母細胞瘤中高表達（P=3.666e-05），并且與腎母細胞瘤患者總生存時間有關（P=0.008）；CDC20在腎母細胞瘤中高表達（P=3.667e-05），與腎母細胞瘤患者總生存時間有關（P=0.036），其余核心蛋白與腎母細胞瘤患者總生存時間無關（P＞0.05），見圖6、圖7。

2.5免疫細胞浸潤在腎母細胞瘤中的表達情況? 通過利用R語言計算出22種免疫細胞浸潤在腎母細胞瘤的表達情況，繪制百分比圖及熱圖見圖8、圖9。利用R語言中的vioplot包對比腎母細胞瘤患者與正常組免疫細胞浸潤情況，結果發現T cells CD4 memory activated（P=0.026）、T cells follicular helper（P=0.031）、Macrophages M0（P=0.005）、Dendritic cells activated（P=0.025）的表達高于正常對照組，而Plasma cells（P=0.023）、T cells CD4 memory resting（P=0.002）、NK cells resting（P=0.045）、Monocytes（P=0.013）在腎母細胞瘤中低表達，見圖10。

2.6 CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤中的表達與免疫細胞浸潤的相關性? 將CDCA8基因、CDC20基因及22種免疫細胞浸潤的表達數據導入SPSS 23.0，分析CDCA8與免疫細胞浸潤的相關性及CDC20與免疫細胞浸潤的相關性，結果得到在腎母細胞瘤中6種免疫細胞浸潤與CDCA8基因的表達具有相關性，其中與NK cells activated（P=0.000，r=0.561）、Macrophages M0（P=0.000，r=0.432）呈正相關，與T cells CD4 memory resting（P=0.002，r=-3.840）、NK cells resting（P=0.002，r=-3.820）、Monocytes（P=0.003，r=-0.364）、Mast cells resting（P=0.043，r=-0.254）呈負相關。在CDC20與免疫細胞浸潤相關性分析中，有5種免疫細胞浸潤與CDC20的表達具有相關性，其中正相關免疫細胞浸潤包括B cells naive（P=0.010，r=0.322）、T cells follicular helper（P=0.000，r=0.490）、NK cells resting（P=0.008，r=0.326）；而T cells CD8（P=0.025，r=-0.280）、NK cells activated（P=0.008，r=-0.330）呈負相關，見表1、表2。

3討論

腎母細胞瘤早期癥狀主要以無意中發現腹部包塊為主，雖然目前治療生存率較高，但是治療后復發及遠期較差的生存質量仍然是臨床上需解決的問題。本研究通過下載GEO數據庫中腎母細胞瘤相關基因表達譜數據，篩選出差異表達基因，通過對差異表達基因進行蛋白互作網絡構建，篩選出15個核心蛋白。在Target數據庫中，發現核心蛋白中的CDCA8及CDC20在腎母細胞瘤中的表達高于正常組織，并且與腎母細胞瘤患者預后的相關。目前CDCA8及CDC20在多個腫瘤中已有研究發表。Wu B等[12]研究發現，CDCA家族基因中的CDCA2、CDCA3、CDCA5及CDCA8在肝癌中高表達，并且均與肝癌患者的總生存時間具有相關性。Phan NN等[13]研究發現CDCA3、CDCA5和CDCA8在乳腺癌人體標本及實驗室癌細胞的表達均高于正常對照組，并且高表達CDCA8提示較差的無復發生存率。Shi Q等[14]研究發現，通過Western blot 等檢測發現在60例腎母細胞瘤中的CDC20蛋白呈高表達，并且利用Kaplan-Meier生存分析統計發現高表達CDC20蛋白提示較差的總生存時間。

目前多個研究已有關于免疫細胞浸潤的分析，其中Ding J等[15]探討了免疫細胞浸潤在乳腺癌中的表達，同時分析SKA家族基因SKA1/2/3在乳腺癌中的表達，結果發現SKA1/2/3的表達與免疫細胞浸潤具有相關性。Zhang H等[16]在肝癌中探討免疫細胞浸潤在肝癌中的表達情況，結果發現免疫細胞Mast Cells Resting在肝癌中表達較正常組織高，并且與肝癌患者的預后有關。Yang ML等[17]在頭頸部鱗狀細胞癌中分析了22種免疫細胞浸潤的表達，并且發現SLC13A4與Monocytes、M1 macrophages、M2 macrophages、resting CD4+ memory T cells等呈負相關，而與plasma cells、T follicular helper cells、naive B cells呈正相關。Tian Z等[18]研究發現，TPM家族基因TPM1-4在肝癌中均高表達，TPM3是肝癌的獨立預后因子，并且TPM1-4的表達均與肝癌中的免疫細胞浸潤具有相關性。Lin Z等[19]研究發現，LncRNA ADAMTS9-AS2在肺癌中低表達，并且該LncRNA的表達量與免疫細胞NK CD56 bright cells、Th2 cells及TReg具有負相關性，與NK cells、T cells、T helper cells、Macrophages等免疫細胞具有正相關性。研究發現[20]，CCL8基因在皮膚黑色素瘤中的表達與患者預后相關，并且發現CCL8的表達與免疫細胞M1 macrophages的表達具有相關性。本研究通過利用R語言計算出GEO表達譜數據中的免疫細胞浸潤的表達，并且發現在腎母細胞瘤中T cells CD4 memory activated、T cells follicular helper、Macrophages M0、Dendritic cells activated免疫細胞呈高表達，而Plasma cells、T cells CD4 memory resting、NK cells resting、Monocytes在腎母細胞瘤中低表達。此外，本研究結果顯示，CDCA8基因的表達與NK cells activated、 Macrophages M0、T cells CD4 memory resting、NK cells resting、Monocytes、Mast cells resting具有相關性；而CDC20的表達與B cells naive、T cells follicular helper、NK cells resting、T cells CD8、NK cells activated具有相關性。這些結果提示CDCA8及CDC20有可能通過參與調控腫瘤免疫細胞影響腎母細胞瘤的進展。

綜上所述，CDCA8及CDC20有可能成為腎母細胞瘤患者治療的新潛在靶點。但本研究目前僅在數據庫中分析得出結果，需進一步行實驗驗證。

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收稿日期：2023-01-09；修回日期：2023-06-16

編輯/杜帆