3種方法對1株臨床疑難菌的鑒定及結(jié)果比較

許一丹,謝成彬,蘇 喆,王頻佳△

1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院臨床微生物學(xué)教研室,四川成都 610500;2.四川省婦幼保健院/成都醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗科,四川成都 610045

細(xì)菌的準(zhǔn)確鑒定是細(xì)菌學(xué)中最重要、最具挑戰(zhàn)性的問題之一,也是抗感染治療的基礎(chǔ)。細(xì)菌鑒定的方法有很多種,常用的包括形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定等。由于基于生化鑒定原理的自動微生物鑒定儀早在1985年就進(jìn)入我國臨床實驗室,并從20世紀(jì)90年代至今廣泛用于臨床標(biāo)本的檢測,因此細(xì)菌生化鑒定是目前臨床最常用的細(xì)菌鑒定方法[1-3]。但由于細(xì)菌的種類繁多,存在多樣性和復(fù)雜性,選擇的生化鑒定特征可能難以代表全部被鑒定菌株,特別是臨床少見菌、罕見菌和未明確分類的細(xì)菌,生化鑒定往往難以發(fā)揮作用。本課題組前期從臨床標(biāo)本中分離出1株細(xì)菌,經(jīng)生化鑒定疑似為鹽單胞菌(Halomonas),但無法準(zhǔn)確鑒定其菌種。針對這株疑難菌,本研究將利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、16S rRNA序列分析和基于全基因組測序(WGS)的基因組序列比對3種方法進(jìn)行菌種鑒定,并對鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2018年7月從四川省婦保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的1例患兒血液標(biāo)本中分離出1株革蘭陰性菌,生化鑒定結(jié)果顯示該菌疑似為鹽單胞菌屬的細(xì)菌,菌株編號為18071143。

1.2主要試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司),Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株培養(yǎng) 將受試菌株18071143接種于哥倫比亞血瓊脂平板,35 ℃培養(yǎng)24～48 h,再次轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板,35 ℃培養(yǎng)18～24 h,挑取純菌,按照實驗要求進(jìn)行后續(xù)的MALDI-TOF MS檢測、16S rRNA測序分析以及基因序列比對。

1.3.2MALDI-TOF MS檢測 按照儀器說明書操作[4]步驟進(jìn)行操作。

1.3.316S rRNA 序列分析 16S rRNA基因測序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。將測序所得的16S rRNA 序列輸入EZBioCloud細(xì)菌16S鑒定數(shù)據(jù)庫 (https：//www.ezbiocloud.net/identify)[5-6],進(jìn)行序列相似性分析。物種水平鑒定以99%核苷酸相似度為標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3.4基于WGS的基因組序列比對 WGS由北京百邁客生物科技有限公司完成。將與菌株18071143的16S rRNA 基因序列相似性>99%的模式菌株作為平均核苷酸一致性(ANI)分析的對比菌株。利用美吉生物云工具(https：//cloud.majorbio.com/page/tools/)進(jìn)行ANI分析,使用ANIm和ANIb 2種方法計算ANI值。此外,將菌株18071143的基因組序列與基因組分類數(shù)據(jù)庫(GTDB)[8]進(jìn)行比對,以獲得菌種信息。

1.3.5系統(tǒng)發(fā)育分析 基于WGS中的16S rRNA序列和看家基因(dnaG,frr,infC,nusA,pgk,pyrG,rplA,rplB,rplC,rplD,rplE,rplF,rplK,rplL,rplM,rplN,rplP,rplS,rplT,rpmA,rpoB,rpsB,rpsC,rpsE,rpsI,rpsJ,rpsK,rpsM,rpsS,smpB,tsf),選擇在GTDB中種屬水平上與菌株18071143最接近的20株菌,通過MEGA7.0軟件采用近鄰相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.6基因組聚類分析 通過Spearman相關(guān)性分析,在COG和KEGG功能上對基因組進(jìn)行聚類分析,評估菌株18071143和與其在16S rRNA基因序列相似性>99%的模式菌株之間基因組水平上的親緣關(guān)系。相關(guān)系數(shù)越接近于1,表明樣本間相關(guān)性越好。

2 結(jié) 果

2.1MALDI-TOF MS檢測 MALDI-TOF MS對菌株18071143的鑒定未出現(xiàn)低分辨和無法鑒定的情況,鑒定結(jié)果為Halomonas hamiltonii。

2.216S rRNA序列分析 菌株18071143的16S rRNA 基因序列的GenBank登錄號是MZ097522.1。該菌株的16S rRNA序列經(jīng)與細(xì)菌16S鑒定數(shù)據(jù)庫比對后,得到相似度較高的細(xì)菌,相似性排名前5的細(xì)菌見表1,其中菌株18071143與Halomonas hamiltonii、Halomonas stevensii、Halomonas johnsoniae的相似度均>99%。

表1 菌株18071143的16S rRNA序列比對結(jié)果

2.3基因組序列比對 菌株18071143的全基因組序列的GenBank登錄號是CP078120.1。通過ANIm和ANIb 2方法分別計算菌株18071143與Halomonas hamiltonii、Halomonas stevensii和Halomonas johnsoniae 3種鹽單胞菌的ANI值。2種算法均顯示菌株18071143與Halomonas stevensii的親緣關(guān)系最近(ANIb= 0.975 1,ANIm= 0.978 6)。將菌株18071143與GTDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),與菌株18071143最為相似的細(xì)菌是Halomonas stevensii,見表2。故基于WGS的序列比對分析,菌株18071143被鑒定為Halomonas stevensii。

表2 菌株18071143與GTDB數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析 菌株18071143基因組中預(yù)測到6個16S rRNA和31個看家基因。基于16S rRNA和看家基因分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,見圖1和圖2。16S rRNA和看家基因的進(jìn)化樹均顯示,菌株18071143與Halomonas stevensii的親緣關(guān)系最為接近。

圖1 菌株18071143與20株鹽單胞菌的16S rRNA系統(tǒng)的進(jìn)化樹

圖2 菌株18071143與20株鹽單胞菌的看家基因系統(tǒng)的進(jìn)化樹

2.5基因組聚類分析 基于的COG和KEGG功能對基因組進(jìn)行聚類分析,菌株18071143與Halomonas stevensii的相關(guān)系數(shù)分別是0.993 5和0.703 7,相關(guān)性最高,因此菌株18071143與Halomonas stevensii的親緣關(guān)系最為接近。見圖3。

注：A是基于COG功能分類的結(jié)果;B是基于KEGG功能注釋的結(jié)果。

3 討 論

作為常規(guī)細(xì)菌鑒定方法的生化試驗雖操作簡單,但需要一定的培養(yǎng)時間,且對于一些細(xì)菌只能達(dá)到區(qū)分菌屬的程度。MALDI-TOF MS技術(shù)是近年來快速發(fā)展的一種用于鑒定多肽、蛋白質(zhì)的新型軟電離質(zhì)譜技術(shù),由于其具有快速、準(zhǔn)確、高通量、易于操作和重復(fù)性好等優(yōu)點,該技術(shù)越來越廣泛地取代常規(guī)方法成為細(xì)菌鑒定的一線工具[9-11]。16S rRNA基因測序被認(rèn)為是一種成熟的分類學(xué)研究方法[12],特別適用于MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫中無數(shù)據(jù)細(xì)菌的鑒定[12-15]。另外,需要進(jìn)行生物信息學(xué)分析,且成本較高的基于WGS的菌種鑒定因其方法的高分辨率,使之成為傳染病診斷和感染源追蹤的一項非常有前景的技術(shù)[16]。在基因組水平上,ANI分析被認(rèn)為是菌種鑒定的神器。普遍認(rèn)為親緣關(guān)系較近的種群間ANI值應(yīng)為70%～75%,而定義一個種的ANI值需要達(dá)到95%～96%[17-18]。ANI值一般可以通過2種運算方法得出：一種是以BLASTn方法為基礎(chǔ)(ANIb),另一種以MUMmer運算法則為基礎(chǔ)(ANIm)。ANI具有方便、快速、分辨率高的優(yōu)點,近年來被廣泛用于細(xì)菌鑒定。ZHOU等[19]通過高通量測序技術(shù)和ANI識別一個名為AV208的革蘭陽性球菌菌株。JIN等[20]利用ANIb和全基因組測序的系統(tǒng)發(fā)育分析,糾正奈瑟菌屬中錯誤的菌種分類,并指出GenBank中的Neisseria mucosa(n=13)和Neisseria sicca(n=16)應(yīng)使用ANIb和高分辨率系統(tǒng)發(fā)育分析重新進(jìn)行分類。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),MALDI-TOF MS、16S rRNA基因測序和WGS對菌株18071143在菌屬層面的鑒定一致性達(dá)到100%,但在菌種水平的鑒定上卻存在差異。MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果為Halomonas hamiltonii。16S rRNA基因序列分析最為相似的細(xì)菌也是Halomonas hamiltonii,但菌株18071143與3種鹽單胞菌的序列相似度均>99%,且不同種之間的分辨率低于0.8%。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI) 指南[21]要求,本次16S rRNA基因序列分析無法在菌種水平上鑒定細(xì)菌。基于WGS的ANI分析發(fā)現(xiàn),菌株18071143更傾向于是Halomonas stevensii,這一點也從該菌的基因組序列與GTDB數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果、與相似菌的系統(tǒng)發(fā)育以及基因組的聚類分析得到證實。以往有學(xué)者指出,16S rRNA序列分析的主要問題是無法準(zhǔn)確確定物種[22-23]。盡管16S rRNA基因序列被廣泛用于分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究,但在區(qū)分密切相關(guān)的菌株和物種時有一定的局限性,尤其是沒有基于與公共數(shù)據(jù)庫中序列的相似性來明確識別物種的普遍認(rèn)可的閾值[24]。MALDI-TOF MS也存在同樣的問題。MALDI-TOF MS方法操作簡便,非常適用于臨床工作,但儀器數(shù)據(jù)庫的完備性也會影響到結(jié)果的可靠性[25]。細(xì)菌基因組包含其全部的遺傳信息,確定基因組序列成為了解細(xì)菌生物學(xué)特性與功能特征的基礎(chǔ)和前提。細(xì)菌全基因組序列信息能夠?qū)?xì)菌的鑒定提供最高的分辨率。

本研究利用3種方法對臨床常規(guī)方法無法鑒定到種的鹽單胞菌進(jìn)行了菌種鑒定,結(jié)果顯示基于WGS的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。MALDI-TOF MS方法簡單、快速,適用于臨床常規(guī)工作;16S rRNA序列分析分辨率較差,對于某些疑難菌難以準(zhǔn)確鑒定;WGS分辨率高,適用于具有相似遺傳學(xué)特征的菌種之間的鑒別。因此,在臨床工作中若分離到罕見菌株和疑難菌株,建議使用WGS技術(shù)獲取細(xì)菌全基因組序列信息,以全面了解該菌的生物學(xué)特性與功能特征。