銅藍(lán)蛋白用于糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)\斷的臨床價(jià)值

肇莉莉,喻 磊,王 萍,馬為梅

陜西省西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院眼科,陜西西安 710004

氧化損傷是糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)病因?qū)W中的一個(gè)關(guān)鍵因素[1]。高糖狀態(tài)通過各種機(jī)制產(chǎn)生的活性氧(ROS)往往會(huì)破壞重要的生物分子,如DNA、蛋白質(zhì)和脂膜,從而破壞細(xì)胞的正常生理狀態(tài)[2]。值得注意的是,視網(wǎng)膜極易受到氧化應(yīng)激的損害。增生性DR(PDR)和/或糖尿病性黃斑水腫的發(fā)展可導(dǎo)致DR患者的視力損害,目前已經(jīng)開發(fā)出多種方法以量化氧化應(yīng)激狀態(tài)。在其他疾病中,銅藍(lán)蛋白(CP)被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物之一,一方面可促進(jìn)鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合;另一方面可抑制超氧物誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化機(jī)制[3]。而糖尿病患者CP水平升高可能是對(duì)循環(huán)中未結(jié)合的Fe2+增加的一種保護(hù)性反應(yīng),這將成為自由基進(jìn)一步誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的催化劑[4-5]。因此,本研究旨在分析CP水平與DR進(jìn)展的關(guān)系,其可能作為診斷糖尿病或DR的標(biāo)志物,從而有助于改善其管理和患者預(yù)后?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對(duì)2016年1月至2020年12月在陜西省西安市人民醫(yī)院眼科治療的196例2型糖尿病(T2DM)患者進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性、觀察性、基于醫(yī)院病例的對(duì)照研究,其中男57例、女139例,年齡40～89歲、平均(71.21±9.80)歲。另外按3∶1比例選擇年齡和性別匹配的70例無(wú)糖尿病患者作為對(duì)照組,其中男17例、女53例,年齡41～87歲、平均(69.57±9.35)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：T2DM患者符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013年版)》[6]和/或《糖尿病視網(wǎng)膜病變防治專家共識(shí)》[7]中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn);具有完整的病史記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在可能影響血清CP水平的情況,如腎病、妊娠、口服避孕藥、銅中毒、缺鋅、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或任何急性或慢性炎癥性疾病等;合并糖尿病腎病患者、其他系統(tǒng)性急性或慢性炎癥性疾病患者;除DR之外的視網(wǎng)膜病變;近3個(gè)月內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素類藥物或玻璃體腔注射抗內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物治療。所有研究對(duì)象均知曉本研究,并簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)陜西省西安市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究方案均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行操作。

1.2眼科檢查 所有T2DM患者均接受了完整的眼科檢查,包括裸眼視力(UCVA)、最佳矯正視力(BCVA)測(cè)量(經(jīng)LogMAR轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì))、對(duì)角膜、前房、晶狀體和前玻璃體采用裂隙燈生物顯微鏡檢查。擴(kuò)張眼底檢查采用直接檢眼鏡、90 D透鏡裂隙燈生物顯微鏡和間接檢眼鏡(如需要)。眼壓(IOP)測(cè)量采用Goldman壓平眼壓計(jì)。所有DR患者均進(jìn)行光學(xué)相干斷層掃描(OCT)和熒光素眼底血管造影(FFA)。根據(jù)眼科檢查結(jié)果,將T2DM患者分為單純T2DM患者(DM組)和DR患者(DR組)。根據(jù)眼底鏡檢和血管造影及國(guó)際臨床DR嚴(yán)重程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度分級(jí),將DR患者分為輕度及中度非增生性DR(NPDR)86例和重度NPDR及PDR 32例,DR嚴(yán)重程度分級(jí)包括：(1)無(wú)視網(wǎng)膜病變(無(wú)異常);(2)NPDR。輕度NPDR(僅有微血管瘤)、中度NPDR(有微血管瘤,但嚴(yán)重程度較低)、重度NPDR(視網(wǎng)膜內(nèi)4個(gè)象限各有20個(gè)以上出血、2個(gè)以上象限有明確的靜脈串珠、1個(gè)以上象限出現(xiàn)嚴(yán)重微血管異常,出現(xiàn)以上任意一條即可判定);(3)PDR。新生血管、玻璃體/視網(wǎng)膜前出血,出現(xiàn)以上任意一條或多條即可判定。

1.3血清及房水標(biāo)本檢測(cè) 入組時(shí)收集所有參與者的血液標(biāo)本,抽取靜脈血,將標(biāo)本置于冰上并在1h內(nèi)離心(3 500×g,4 ℃條件下離心15 min),將上清液儲(chǔ)存在—20 ℃環(huán)境中直至分析。所有DR患者房水標(biāo)本采用角膜緣內(nèi)1 mm前房穿刺,采集未稀釋的房水標(biāo)本0.15～0.20 mL,特別注意避免血液污染,標(biāo)本立即冷卻并儲(chǔ)存在—70 ℃環(huán)境中。(1)房水及血清CP測(cè)定分別采用Somani法和Ambade法。0.5 mmol/L色原溶液(Reagent-1)制備：將159.65 mg諾氟沙星溶解于含0.2% Triton X-100的乙酸鹽緩沖液(0.45 mol/L,pH值為5.4)中。2.04 mmol/L底物溶液(Reagent-2)制備：320.00 mg二硫蘇糖醇(DTT)和800.00 mg硫酸亞鐵銨依次溶解在1 000.00 mL蒸餾水中。Reagent-1和Reagent-2在4 ℃和室溫下均能穩(wěn)定6個(gè)月以上。6.0 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品制備：將2.896 g十二水合硫酸鐵(Ⅲ)銨溶于1 000 mL(0.2 mmol/L)乙酸中。50 μL標(biāo)本加入1 000 μL Reagent-1中混勻。間隔1 min后,加入150 μL Reagent-2。將混合液加入Shimadzu CL-750分光光度計(jì),測(cè)定波長(zhǎng)377 nm?？瞻仔Ｕ河谜麴s水代替房水及血清標(biāo)本進(jìn)行空白校正。(2)房水超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.13組受試者臨床資料比較 經(jīng)眼科檢查,有78例患者納入DM組,118例患者納入DR組。3組受試者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、糖尿病病程、合并高血壓患者例數(shù)、UCVA、LogMAR、眼軸長(zhǎng)度、糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白膽固醇、尿素氮、肌酐、血清CP水平及他汀藥物使用史患者比例比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且DR組血清CP水平顯著高于對(duì)照組和DM組(P<0.001)。見表1。

表1 3組受試者臨床資料比較或n(%)或M(P25,P75)]

2.2DR患者血清CP與房水CP水平、MDA、SOD水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,DR患者血清CP水平與房水CP及MDA水平均呈正相關(guān)(r=0.620,P<0.001;r=0.198,P=0.001),與房水SOD水平呈負(fù)相關(guān)(r=—0.196,P=0.001)。見圖1。

注：A為血清CP水平與房水CP水平的相關(guān)性;B為血清CP水平與房水MDA水平的相關(guān)性;C為血清CP水平與房水SOD水平的相關(guān)性。

2.3多因素Logistic回歸分析影響T2DM發(fā)生DR的影響因素 將T2DM患者是否發(fā)生DR(T2DM=0,DR=1)或DR患者是否進(jìn)展為重度NPDR/PDR(輕中度NPDR=0,重度NPDR/PDR=1)作為因變量進(jìn)行賦值,經(jīng)多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,血清CP水平為T2DM患者發(fā)生DR或者DR患者進(jìn)展至重度NPDR/PDR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05)。見表2、表3。

表2 多因素Logistic回歸分析影響T2DM發(fā)生DR的臨床因素

表3 多因素Logistic回歸分析影響T2DM進(jìn)展為重度NPDR/PDR的臨床因素

2.4血清CP水平對(duì)DR的診斷效能分析 ROC曲線結(jié)果顯示,血清CP診斷T2DM患者的曲線下面積(AUC)為0.672(95%CI：0.586～0.758),靈敏度和特異度分別為42.3%、87.1%,見圖2A。血清CP水平診斷T2DM患者發(fā)生DR的AUC為0.833(95%CI：0.776～0.889),靈敏度和特異度分別為74.6%、82.1%,見圖2B;血清CP診斷NPDR早期的AUC為0.777(95%CI：0.705～0.848),靈敏度及特異度分別為73.3%、75.6%,見圖2C;血清CP診斷重度NPDR的AUC為0.890(95%CI：0.827～0.953),靈敏度和特異度分別為75.0%、89.5%,見圖2D。

注：A為糖尿病患者的AUC;B為DR患者的AUC;C為輕中度NPDR患者的AUC;D為重度NPDR患者的AUC。

3 討 論

DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要病理變化包括異常血管增殖引起的眼內(nèi)環(huán)境變化,導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織缺氧缺血性損傷[1]。本研究中對(duì)照組、DM組及DR組患者的血清CP水平依次升高,提示CP可能與DR疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

糖尿病是一種氧化應(yīng)激增加的狀態(tài),而氧化應(yīng)激也是DR發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高血糖引起的局部缺血和某些血管活性化學(xué)物質(zhì)(包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)釋放,這些化學(xué)物質(zhì)會(huì)激發(fā)玻璃體腔后壁上的視網(wǎng)膜表面形成新生血管。但這些新生血管非常脆弱且極易破裂,當(dāng)玻璃體開始收縮時(shí),會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜剝離和視力下降。同時(shí)缺血狀態(tài)下產(chǎn)生的ROS通過各種機(jī)制破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜等重要生物分子,破壞細(xì)胞的正常生理功能,視網(wǎng)膜非常容易受到氧化應(yīng)激的損害[9-11]。臨床認(rèn)為研究氧化應(yīng)激標(biāo)志物在血清、玻璃體、房水等中的動(dòng)態(tài)變化和相關(guān)關(guān)系,對(duì)DR疾病控制、監(jiān)測(cè)其進(jìn)展有重要意義[12-14]。本研究結(jié)果顯示房水CP、SOD及MDA與血清CP水平均存在相關(guān)性(P<0.05),SOD是主要的抗氧化酶,SOD催化超氧自由基歧化,生成分子氧或過氧化氫[10]。MDA則為研究最多的脂質(zhì)氧化最終產(chǎn)物[13]。該結(jié)果提示血清CP水平可反映眼內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化。

CP是一種含銅的α2球蛋白,其主要在肝臟中合成,然后分泌進(jìn)入循環(huán),到達(dá)其他組織和器官。CP作為一種鐵氧化物酶,可以促進(jìn)Fe2+/Cu1+向Fe3+/Cu2+的轉(zhuǎn)化,其參與人體內(nèi)許多重要的生理活動(dòng),在維持機(jī)體銅與鐵等微量元素的平衡方面起著重要的作用。此外,CP也被認(rèn)為是一種非特異性急性時(shí)相蛋白,在發(fā)生感染、炎癥、糖尿病和創(chuàng)傷時(shí)表達(dá)增加[15-16]。CP已被發(fā)現(xiàn)在心血管疾病中存在差異表達(dá),如顧偉等[17]發(fā)現(xiàn)血清CP水平可能參與高血壓并射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展,并分析其原因可能與CP通過銅轉(zhuǎn)運(yùn)過程而發(fā)揮血管新生及抗氧化等作用有關(guān)。同時(shí),有研究發(fā)現(xiàn)CP水平升高與糖尿病腎病的進(jìn)展呈正相關(guān),其在氧化應(yīng)激增加的情況下發(fā)揮促氧化劑的作用,雖然CP由于其鐵氧化酶活性而具有抗氧化特性,但ROS生成的增加破壞了CP與銅的結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)ROS的形成和LDL氧化[18]。同樣,在本研究中隨著DR的進(jìn)展,血清CP水平逐漸升高,與SATYANARAYANA等[8]的研究結(jié)論相符。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),血清CP水平診斷T2DM患者是否發(fā)生DR以及診斷輕度及中度NPDR與重度NPDR及PDR均有良好效能。

綜上所述,血清CP水平在DR患者中呈異常高表達(dá),且隨著DR病變嚴(yán)重程度的增加而升高,表明CP作為促氧化劑,可參與調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而影響DR的發(fā)生/發(fā)展。此外血清CP高水平是T2DM患者發(fā)生DR或DR進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,檢測(cè)血清CP水平有助于DR的診斷或反映疾病進(jìn)展程度。