新型鎂合金對金黃色葡萄球菌生物學特性影響的體外研究

劉小榮 楊國清 梁文強 張玉娟 張鵬飛 張 靜 章曉波 王勇平▲

1.甘肅省第二人民醫(yī)院檢驗科，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730000；3.南京工程學院材料工程學院，江蘇南京 211167

金黃色葡萄球菌是一種容易形成生物膜的革蘭氏陽性球菌，在相關(guān)黏蛋白介導作用下，可定植、黏附于植入物，如心臟瓣膜、骨科植入物等表面形成生物膜，一旦發(fā)生植入物感染，往往需要取出植入物、擴大清創(chuàng)、延長抗生素使用時間，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[1-4]。植入材料鎂合金是一種可降解金屬材料，具有良好的生物相容性及生物可降解性，鎂合金降解后產(chǎn)生的OH-和Mg2+具有抗菌的作用，降低了細菌的活力，然而新型鎂合金Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr對金黃色葡萄球菌生物學特性的影響尚無研究報道，故本研究探討新型鎂合金Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr對金黃色葡萄球菌生物學特性的影響，從而為鎂合金抑制金黃色葡萄球菌生物學行為提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金材料由南京工程學院提供。金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC25923）由甘肅省第二人民醫(yī)院檢驗科提供。

1.2 主要儀器

賽默飛MK3酶標儀（上海蓓米爾生物科技有限公司）；DHP-9602 35℃恒溫培養(yǎng)箱（上海左樂儀器有限公司）；LMQ.C-80E高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；BSC-3FA2鑫貝西生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；ATB-new微生物鑒定及藥敏分析儀（法國梅里埃生物有限公司）；單槽超聲波清洗機（陜西凱德力環(huán)保科技有限公司）。

1.3 鎂合金試樣制備

將新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金制成10 mm×3 mm圓柱狀試樣，用無菌去離子水沖洗干凈，高壓滅菌后備用。

1.4 金黃色葡萄球菌懸液制備

將金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC25923）干粉接種于哥倫比亞血瓊脂平板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。挑取分純好的單個金黃色葡萄球菌菌落分別配置0.5、0.6、0.7、0.8、0.9麥氏濁度菌懸液各18 ml。分別相當于1.5×108、1.8×108、2.1×108、2.4×108、2.7×108CFU/ml。

1.5 金黃色葡萄球菌增殖實驗

實驗分為實驗組及對照組，各設(shè)3個復(fù)孔。實驗組分別各吸取不同濃度金黃色葡萄球菌懸液3 ml加入含有鎂合金試樣的24孔培養(yǎng)板中；對照組分別將3 ml不同濃度金黃色葡萄球菌懸液加入不含有鎂合金試樣的24孔培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1、3、5、7 d，取出培養(yǎng)板，用無菌槍將菌懸液吹打混勻，每孔吸取100 μl菌懸液轉(zhuǎn)移至酶標儀中，在450 nm處讀取各組菌懸液OD值。

1.6 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗、溶血素實驗、抗生素抑菌環(huán)實驗

實驗分為實驗組（新型鎂合金）及對照組（不含新型鎂合金），各設(shè)3個復(fù)孔。實驗組吸取金黃色葡萄球菌懸液3 ml加入含有鎂合金試樣的無菌玻璃試管中；對照組將3 ml金黃色葡萄球菌懸液加入不含有鎂合金試樣的無菌玻璃試管中。將試管放入37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)1、3、5、7 d，取出試管，將金黃色葡萄球菌菌懸液轉(zhuǎn)種到哥倫比亞血瓊脂平板，挑取單個菌落分別進行金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗、溶血素實驗、抗生素抑菌環(huán)實驗。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，行t檢驗，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌增殖實驗

在同一時間點，不同濃度實驗組OD值比對照組明顯更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（表1）。在不同時間點，相同濃度實驗組與對照組比較，OD值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（圖1）。隨著培養(yǎng)時間延長，相同濃度實驗組與對照組OD值之差逐漸上升（P＜ 0.05）（圖2）。

圖1 金黃色葡萄球菌增殖實驗

圖2 金黃色葡萄球菌增殖實驗

表1 兩組金黃色葡萄球菌增殖情況（OD值）（）

表1 兩組金黃色葡萄球菌增殖情況（OD值）（）

濁度1 d 3 d 5 d 7 d實驗組對照組實驗組對照組實驗組對照組實驗組對照組0.50.354±0.0080.554±0.0050.809±0.0051.269±0.0121.153±0.0051.919±0.0051.412±0.0162.334±0.010 0.60.433±0.0030.726±0.0071.005±0.0041.468±0.0051.356±0.0052.131±0.0111.731±0.0042.719±0.015 0.70.519±0.0650.884±0.0041.270±0.0051.735±0.0061.673±0.0082.496±0.0132.012±0.0063.092±0.006 0.80.551±0.0030.993±0.0061.328±0.0071.916±0.0061.759±0.0052.691±0.0062.105±0.0933.299±0.016 0.90.563±0.0031.142±0.0071.395±0.0122.178±0.0081.834±0.0063.027±0.0112.202±0.0173.665±0.012

2.2 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

與對照組比較，實驗組凝集顆粒較小，且隨著培養(yǎng)時間延長，凝集顆粒逐漸變小（圖3）。

圖3 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗（光鏡，40×）

2.3 金黃色葡萄球菌溶血素實驗

與對照組比較，實驗組β溶血環(huán)較小，且隨著培養(yǎng)時間延長，β溶血環(huán)逐漸減弱，而且培養(yǎng)7 d后，β溶血環(huán)消失（圖4）。

圖4 金黃色葡萄球菌溶血素實驗（光鏡，40×）

2.4 抗生素抑菌環(huán)實驗

與對照組比較，實驗組所有抗生素在1、3、5、7 d抑菌環(huán)直徑較大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（圖5）。

圖5 抗生素抑菌環(huán)實驗

3 討論

植入物感染診治困難在于植入材料表面細菌生物膜的形成[5-8]，金黃色葡萄球菌在相關(guān)黏蛋白介導下，可定植、黏附于植入物表面，形成細菌生物膜[9-11]。

近年來，本研究課題組對系列鎂合金進行研究，結(jié)果表明鎂合金材料對成骨細胞具有良好的細胞相容性，對骨組織具有良好的組織相容性，對機體重要臟器具有良好的生物安全性[12-18]，Robinson等[19-20]研究表明鎂合金在人體環(huán)境中降解后可殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見細菌。本研究首先探討鎂合金對金黃色葡萄球菌增殖的影響，研究結(jié)果顯示在同一時間點不同濃度實驗組OD值比對照組明顯更低；在不同時間點相同濃度實驗組與對照組比較，OD值明顯降低；隨著培養(yǎng)時間延長，相同濃度實驗組與對照組OD值之差逐漸上升，結(jié)果表明鎂合金具有抑制金黃色葡萄球菌增殖的能力；隨著細菌濃度的增加，鎂合金抑制細菌增殖的能力也逐漸增加。研究結(jié)果還顯示相同濃度對照組與實驗組OD值之差在第5天之后逐漸減低，表明細菌的增殖能力逐漸降低。隨后本研究探討了鎂合金對金黃色葡萄球菌血漿凝固酶、菌溶血素、抗生素抑菌等生物學特性的影響，研究結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間延長，血漿凝固酶實驗?zāi)w粒逐漸變小；葡萄球菌溶血素（β溶血環(huán)）逐漸減小；各抗生素抑菌環(huán)直徑逐漸增大，結(jié)果表明鎂合金對金黃色葡萄球菌的生物學特性有明顯的影響。

綜上所述，新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金具有抑制金黃色葡萄球菌增殖的能力；同時，鎂合金還能抑制金黃色葡萄球菌血漿凝固酶凝集顆粒及β溶血環(huán)，增強抗生素抑菌環(huán)等生物學特性。