HPLC法測定蒙藥沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的含量

烏雅漢 莫日根 呼和 額爾敦呼 烏日汗 白明君 包書茵▲ 包桂花▲

1.內蒙古民族大學，內蒙古通遼 028000；2.內蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎右旗阿拉坦額莫勒鎮社區衛生服務中心，內蒙古阿拉坦額莫勒鎮 021300；3.內蒙古自治區國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心，內蒙古呼和浩特 010020

沙蓬是蒙醫常用傳統藥材，為藜科沙蓬Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分。蒙文名為楚力格日或楚勒格日，別名為吉刺兒[1-2]。該藥始載于《四部醫典》，其中曰：“楚力格日別名吉刺兒，用于疫熱、毒熱以及腎熱癥”[3]，繼后《認藥學》[4]《認藥白晶鑒》[5]《無誤蒙藥鑒》[6]《遼寧植物》[7]《內蒙古蒙藥材標準》[8]等著作中也見有關于沙蓬的記載。沙蓬味苦、澀，性平，效糙；具有抑疫，清熱，鎮赫依，解毒，利尿等功效，主要治療疫熱增盛引起的神志不清、身目黃染，希日引起的胃刺痛、口糜、齒齦潰爛、尿道灼痛、腎熱等癥。沙蓬中主要含有黃酮類等成分[9]，具有降糖、保護腎臟等藥理作用[10-11]。

本文以沙蓬莖、葉、花為研究對象，采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）同時測定沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的含量，分析比較不同部位中的分布情況，為沙蓬的研究開發提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

實驗材料2022年9月采集于通遼市奈曼旗，由包桂花教授鑒定為藜科沙蓬[Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.]的莖、葉、花。槲皮素（C15H10O7）對照品（批號：100081-201610）、異鼠李素（C11H12O7）對照品（批號：110860-202012）純度＞98%，由中檢院提供，水為高純水，甲醇為色譜純，其他所用乙醇、磷酸、鹽酸試劑等均是分析純。

1.2 儀器

SHIMADZU SPD-20A LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），色譜柱[Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5μm）]，AUW220D電子天平（Max 220 g d=0.01 mg，中國北京），微量進樣器（中國上海），KQ-100超聲波清洗器（中國昆山）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[12-13]

色譜柱為Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），選擇甲醇-0.1%磷酸（58∶42）為流動相，370 nm為檢測波長，30℃為柱溫，1.0 ml/min為流速，10 μl為進樣量。在此條件下槲皮素、異鼠李素的分離度大于1.5，對照品與供試品的色譜圖（圖1）。

圖1 混合對照品（A）、沙蓬葉（B）、沙蓬花（C）、沙蓬莖（D）HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素11.1 mg和異鼠李素10.1 mg，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇制成1 ml中含槲皮素0.042 69 mg和異鼠李素0.168 33 mg的混合溶液[14-15]。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取沙蓬花樣品約0.1 g，置100 ml的具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 ml，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，稱定重量，用乙醇補足減失的重量。再精密加入3.5 ml鹽酸溶液，稱定重量，75℃水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，稱定重量，用乙醇補足減失的重量。搖勻，濾過，精密量取2.0 ml續濾液，即得。詳細換算公式為CX=CR/AR×AX，其中CR為標準品的濃度、AR為標準品的峰面積、CX為樣品的濃度、AX為樣品的峰面積。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積。以槲皮素和異鼠李素的濃度為橫坐標（x），以槲皮素和異鼠李素的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算回歸方程。依次y1=4×106x1+3039，r1=0.999 9，y2=1×106x2+6637，r2=0.999 7。結果表明，槲皮素和異鼠李素分別在0.0107～0.5336 μg、0.0421～2.1038 μg范圍內與峰面積具有很好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，制備供試品溶液，在本次試驗的色譜條件下進樣（n=6），測定色譜峰峰面積值。結果槲皮素和異鼠李素的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.51%和1.35%，表明儀器精密、測量值誤差小。

2.6 穩定性試驗

精密稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，制備供試品溶液，在本次試驗的色譜條件下每隔2 h進樣1次（n=6），共觀察10 h，結果樣品中槲皮素和異鼠李素的相對標準偏差為1.95%和1.05%。表明建立方法中的沙蓬花樣品溶液的穩定性在10 h內良好。

2.7 重復性試驗

稱取同一批次沙蓬花樣品約0.1 g，共6份，精密稱定，在本次試驗的色譜條件下進樣（n=6），測定峰面積值。槲皮素和異鼠李素的相對標準偏差分別為1.88%和1.98%，結果含量測定方法具有良好的重復性。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取同一批次沙蓬花樣品6份，每份約0.05 g，分別加入適量的2種對照品，按2.3方法制備供試品溶液后進樣測定峰面積，并計算回收率。結果沙蓬花樣品溶液中2種成分的回收率分別為100.06%和102.59%，RSD分別為1.52%和1.67%。見表1～2。

表1 槲皮素回收率結果（n=6）

表2 異鼠李素回收率結果（n=6）

2.9 樣品測定

分別稱取沙蓬莖、葉、花約0.1 g，精密稱定，按2.3項下法制備供試品溶液，在本次試驗的色譜條件下進樣（n=6），記錄樣品溶液中2種成分的色譜峰峰面積值，計算其含量。見表3～5。

表3 沙蓬莖含量測定結果（n=6）

表4 沙蓬葉含量測定（n=6）

表5 沙蓬花含量測定（n=6）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

將槲皮素和異鼠李素對照品溶液在200～400 nm進行光譜掃描，結果在370 nm時均有最大吸收并無干擾，所以選擇確定370 nm為檢測波長。

3.2 提取方法的選擇

制備供試品溶液時對比了超聲處理提取和加熱回流提取，加熱回流提取時槲皮素和異鼠李素的含量均高于超聲處理提取，故本研究中選擇加熱回流提取。

3.3 考察加熱回流時間

考察樣品加熱回流0.5、1、1.5 h，1.5 h時樣品中槲皮素和異鼠李素的含量高于0.5 h和1 h，故本試驗采用加熱回流處理1.5 h。

3.4 柱溫的選擇

考察柱溫分別為25℃、30℃、35℃條件對槲皮素和異鼠李素分離效果的影響，結果柱溫為30℃時分離效果好于其他條件，故選擇柱溫為30℃。

本研究以沙蓬不同部位莖、葉、花為研究對象，建立一種同時測定槲皮素和異鼠李素含量的方法，分析比較槲皮素和異鼠李素在沙蓬莖、葉、花中的分布情況。結果表明，沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的總量依次為沙蓬葉＞沙蓬花＞沙蓬莖，并且沙蓬葉中槲皮素和異鼠李素的含量最高，沙蓬莖中槲皮素和異鼠李素的含量最低；在《內蒙古蒙藥材標準·2021年版》中規定，沙蓬干燥地上部分中槲皮素和異鼠李素的總量不得少于0.24%，那么，沙蓬葉和沙蓬花中2種成分的含量均高于0.24%，具有較好的研發前景，為沙蓬不同部位的研究開發提供理論參考。

在本實驗所確定的色譜條件下，沙蓬莖、葉、花中槲皮素和異鼠李素的檢測數據結果表明，理論塔板數按槲皮素峰計算均不低于2500，槲皮素和異鼠李素均基線分離，分離度（R＞ 1.5），拖尾因子T值分別為1.04和1.02。在方法學考察試驗中槲皮素和異鼠李素峰面積的相對標準偏差值均小于2.0%，槲皮素和異鼠李素的回收率分別為100.06%、102.59%，RSD值分別為1.52%、1.67%，表明該方法結果準確，專屬性強、重復性好，所建立的方法可用于蒙藥沙蓬莖、葉、花中該2種成分的含量測定。