基于網(wǎng)絡藥理學探討健脾溫陽方治療原發(fā)性早泄的作用機制

陳文鑠 洪志明 陳子龍 韋 一 王勝杰 邱俊峰 翁浩偉

1.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院男科，廣東深圳 518033

原發(fā)性早泄（primary premature ejaculation，PPE）是指從首次性生活開始即有早泄（premature ejaculation，PE）。PPE為常見的男性功能阻礙性疾病，其特征是陰道內(nèi)射精潛伏發(fā)展時期短，對患者心理健康造成影響[1]。PPE的病因和發(fā)病機制極為復雜，普遍認為是生物學和心理學影響因素共同作用的結(jié)果[2-3]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療PE的藥品有選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、局部麻醉劑、磷酸二酯酶5抑制劑、α-受體阻斷劑等[4-5]，但遠期來看存在耐藥性，并且存在惡心、頭痛、眩暈等不良反應。PE在中醫(yī)學歸屬于“臻疾”等范疇。中醫(yī)學認為，PE與心、肝、腎密切相關，其志在心，其藏在腎，其行在肝[6]。既往研究表明，健脾溫陽方配合西藥治療PPE有一定臨床療效[7]。健脾溫陽方是深圳市中醫(yī)院男科自擬方，其組成包含麩炒枳殼、當歸、肉桂、黃芪、麩炒白術、北柴胡、陳皮、升麻、甘草片、淫羊藿、土鱉蟲、車前草、浮小麥共13味中藥，具有益氣健脾、補腎助陽的功效。然而，健脾溫陽方治療PPE的具體作用機制尚不明確，有待進一步探究。本研究利用網(wǎng)絡藥理學的方法探究健脾溫陽方與PPE的具體作用機制，以期更好地指導臨床。

1 資料與方法

1.1 健脾溫陽方藥物作用靶點收集

經(jīng)過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）應用操作平臺進行藥品有效成分篩選，搜索健脾溫陽方13味中醫(yī)藥的化學活性有效組分，并且挑選出其主要作用目標靶點，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將收集到的所有活性成分對應的目標靶點轉(zhuǎn)化為相互對應的遺傳基因名稱。

1.2 PPE疾病靶點收集

經(jīng)過多種數(shù)據(jù)信息庫來搜集疾病目標靶點，以“primary premature ejaculation”為關鍵詞進行搜索，收集目標靶點，同時把2個數(shù)據(jù)庫的最終處理結(jié)果刪重合并處理。將有效組分目標靶點和疾病目標靶點取交集，繪制韋恩圖。

1.3 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”網(wǎng)絡的繪制

將健脾溫陽方的藥物有效活性成分靶點和PPE的主要作用目標靶點展開交集探究解析，參考依據(jù)運算度數(shù)值（degree），使用Network Analyzer篩選出健脾溫陽方的有效活性成分。

1.4 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建

應用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），針對以上活性成分目標靶點和PPE目標靶點交集后的合計目標靶點展開PPI網(wǎng)絡的建立，運用Cytoscape和ECODE程序排版利用插件對PPI網(wǎng)絡開始中心性解析。

1.5 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”的基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集解析

將交集靶點錄入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO和KEGG解析，分別根據(jù)P值篩選排名前10和前20的數(shù)據(jù)導入生信盒子軟件繪制圖。

2 結(jié)果

2.1 健脾溫陽方藥物作用靶點收集

通過TCMSP平臺檢索出健脾溫陽方中11味藥物的活性成分，黃芪有20個活性成分，白術有7個活性成分，北柴胡有17個活性成分，陳皮有5個活性成分，升麻有17個活性成分，甘草有92個活性成分，枳殼有5個活性成分，當歸有2個活性成分，肉桂有2個活性成分，淫羊藿有23個活性成分，車前草有10個活性成分；通過BATMAN-TCM平臺補充檢索另外2味藥品的化學活性有效組分，土鱉蟲有1個化學活性有效組分，浮小麥有1個化學活性有效組分。刪減重復項，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對化學活性有效組分目標靶點蛋白展開遺傳基因名稱轉(zhuǎn)化處理，并且獲取434個目標靶點。

2.2 PPE疾病靶點收集

共獲得191交集靶點個，見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點圖

2.3 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”網(wǎng)絡的繪制

運用Cytoscape對191個交集目標靶點繪制“活性成分-目標靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2。Network Analyzer運算研究分析獲取344個控制節(jié)點，2458條邊，參考依據(jù)度數(shù)值篩選前15的活性成分，見表1。

表1 度數(shù)值前15的活性成分

圖2 13味中醫(yī)藥活性成分-目標靶點網(wǎng)絡圖

2.4 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建

將191個交集靶點導入STRING數(shù)字庫，調(diào)節(jié)最低要求互動分數(shù)為中置信度（0.4），獲得對應的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)信息，將數(shù)據(jù)信息自動輸入Cytoscape展開分析，最終結(jié)果獲取190個控制節(jié)點，4088條邊，見圖3。運用ECODE程序應用插件能對遺傳基因群，來展開蛋白聚類，在介數(shù)中心性、接近中心性、度中心性研究分析條件下進行中心性分析，結(jié)果篩選出20個核心靶點，見圖4，核心網(wǎng)絡中度數(shù)值前15的靶點見表2。

表2 度數(shù)值前15的關鍵核心靶點

圖3 交集靶點網(wǎng)絡圖

圖4 交集靶點核心網(wǎng)絡分布圖

2.5 “健脾溫陽方藥物活性成分-PPE疾病靶點”的GO和KEGG富集解析

將獲取的各交集靶點利用DAVID進行GO富集解析。最終結(jié)論共獲取760條生物過程（biological process）條目，包括對藥物、外源性刺激、乙醇、雌二醇的反應等作用過程；90條生物細胞有效組分（cellular component）條目，包括質(zhì)膜總體有效組分、突觸前膜的構(gòu)成部分、突觸后膜、質(zhì)膜、神經(jīng)結(jié)構(gòu)分布元投射等有效組分；150條分子功能（nolecular function）條目。參考依據(jù)遺傳基因數(shù)目及差異性排序，繪制3個聚類分析前10的條目，見圖5。

圖5 交集靶點GO分析

將得到的交集靶點利用DAVID進行KEGG富集分析，結(jié)果中P＜ 0.05的通路有169條，根據(jù)校正P值排序前20條目見圖6。主要富集于PI3K-Akt通路、cAMP信號通路等數(shù)字信號通路。

圖6 交集目標靶點KEGG富集分析

3 討論

中醫(yī)藥治療PPE有悠久歷史，相關臨床研究表明，健脾溫陽方聯(lián)合鹽酸帕羅西汀治療PPE的中西醫(yī)結(jié)合療法是理想方案之一[8]。該療法經(jīng)過臨床觀察后發(fā)現(xiàn)，與單獨使用帕羅西汀相比，該療法能夠提高患者的總有效率，延長患者的射精潛伏期，降低不良反應發(fā)生率。

本研究采取網(wǎng)絡藥理學對健脾溫陽方治療PPE的具體作用機制進行探討，能一定程度上體現(xiàn)中醫(yī)學“整體觀念”的治療理念。網(wǎng)絡藥理學結(jié)果顯示，健脾溫陽方治療PPE的關鍵化學成分為槲皮素。槲皮素具有抗炎、抗氧化反應等生物學效應，能進而舒張血管，使陰莖硬度增大，射精閾值提高，還能夠促進其收縮[9]。健脾溫陽方治療PPE的靶點基因有Jun、MAPK3、MAPK1、ESR1、FOS等。常曉茹等[10]研究表明，c-Jun氨基末端激酶高度表達會導致大鼠生殖系統(tǒng)的損傷，其機制可能是提高了睪丸線粒體氧化應激的水平，促使絲裂原激活作用MAPK數(shù)字信號通路中p38渠道。MAPK3受到絲裂原刺激后，處理上游傳出的級聯(lián)反應信號，使核內(nèi)c-Fos、c-Jun等轉(zhuǎn)錄影響因子磷酸化反應處理，進而調(diào)節(jié)控制生殖細胞的增殖和分化[11]。與此同時，MAPK1和MAPK3作為是VEGF數(shù)字信號通路中的重點目標靶點，參與生殖過程[12]。ESR1對雄性生殖機能存在重要的作用，參與生殖器官的生長發(fā)育等過程，當ESR1缺損時，會導致離子轉(zhuǎn)運和水重吸功能受損，從而使精子密度發(fā)生異常[13]。c-FOS蛋白存在于睪丸組織內(nèi)，參加生殖細胞的分化，推動生精細胞的生長發(fā)育，促使精母細胞轉(zhuǎn)化[14]。c-FOS原癌遺傳基因的過度表達還常產(chǎn)生在促性腺激素應用在間質(zhì)細胞引發(fā)睪酮激素分泌的過程中[15]。

健脾溫陽方治療PPE的關鍵通路是PI3K-Akt信號通路和cAMP信號通路。PI3K-Akt信號通路是由酶聯(lián)受體介導的核心數(shù)字信號通路，具有多類生物學功能，對生物細胞生長發(fā)育繁殖、分化和凋亡起到重要應用[16]。在睪丸組織中，PI3K-Akt信號通路可以調(diào)節(jié)睪丸支持細胞的增殖、分化，包括精子的產(chǎn)生[17]。cAMP通路能夠應用在陰莖海綿體平滑肌細胞離子通道來介導其舒張，當血流中前列腺素、血管化學活性腸肽和降鈣素遺傳基因相關多肽等物質(zhì)進入陰莖海綿體生物細胞，促使細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子有效濃度減少，最后陰莖血實際流量增長而引發(fā)勃起行為活動[18]。與此同時，cAMP通過刺激腺苷酸環(huán)化酶/G蛋白體系就會形成cAMP，進而激活作用蛋白激酶，逐漸推動相互對應的睪酮自動形成酶合成增長，進而參加睪酮的生成[19]。

綜上所述，本研究從多方位、多角度預測了健脾溫陽方治療PPE的作用機制，為研究健脾溫陽方治療PPE提供部分理論依據(jù)，但由于中藥成分繁多，健脾溫陽方應用于PPE的具體作用機制仍需進一步的臨床試驗探索，以保證其有效性和安全性。