探討PD-1抑制劑聯合艾坦在三陰性乳腺癌小鼠模型中的應答差異

王 玨 王 睿 張 程 徐忠玲

齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院腫瘤一科，黑龍江齊齊哈爾 161000

乳腺癌位于女性惡性腫瘤之首，侵襲和轉移是導致乳腺癌治療失敗或復發的主要原因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）作為乳腺癌的一個亞型，以雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮細胞生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）缺乏為主要特征[2]，在各種亞型中具有最高的病死率和復發率。TNBC對激素和靶向治療均不敏感，目前主要采取傳統的化療手段，但治療效果較差。基因組不穩定性和高突變負荷使免疫浸潤處于較高水平，從而使TNBC成為乳腺癌亞型中免疫原性最強的亞型[3]。TNBC相較于其他亞型，突出的特點是腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocyte，TILs）和程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）高表達，有研究顯示，程序性死亡-配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）是TNBC患者預后的獨立危險因素[4]。從TNBC的特點及PD-1抑制劑有效性出發，考慮采用PD-1抑制劑治療TNBC，但PD-1抑制劑單藥使用反應率一般不高，且不對所有的腫瘤類型有效，還存在繼發耐藥現象。本研究采用PD-1抑制劑聯合艾坦，探討其在TNBC小鼠模型中的應答差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8周齡雌性BALB/c小鼠32只，體重18～22 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK（京）2019-0017；4T1小鼠乳腺癌細胞由上海弘順生物科技有限公司提供；艾坦片（艾坦）購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H20140103；PD-1抑制劑（拓益JS001）購于君實生物。本研究經過醫院動物醫學倫理委員會批準（倫理審批號：202215）。

1.2 TNBC荷瘤小鼠模型構建

取32只雌性 BALB/c小鼠，禁食飼養12 h后采用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉（4 μl/g），將4T1細胞按3×106/ml濃度接種于腋下胸骨前緣乳腺脂肪墊，每只0.1 ml，觀察接種部位，3 d后出現直徑2～4 mm大小瘤結節，成瘤后7～10 d游標卡尺測量瘤體長徑和短徑計算瘤體體積=（瘤體長徑×瘤體短徑2）/2，腫瘤體積在100 mm3以上為造模成功。

1.3 實驗分組及給藥

將32只TNBC模型小鼠隨機分為模型組、PD-1抑制劑組、艾坦組和聯合組，每組各8只。PD-1抑制劑組給予PD-1抑制劑200 μg/只，經腹膜內注射，成瘤后2周和4周各給藥1次。艾坦組給予艾坦片20 mg/kg灌胃，1次/d，成瘤后次日開始給藥，連續28 d。聯合組按照PD-1抑制劑組和艾坦組劑量同時給藥。模型組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.4 觀察指標及評價標準

1.4.1 計算各組小鼠瘤體體積和抑瘤率 成瘤后7、14、21、28 d于體外采用游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，計算瘤體體積和抑瘤率，抑瘤率=（模型組瘤體體積-干預組瘤體體積）/模型組瘤體體積×100%。

1.4.2 檢測血清、腫瘤組織中PD-L1表達 末次給藥后心臟采血，2500 r/min離心分離15 min后取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（美國Abcam公司，ab279408）檢測血清PD-L1水平。次日脫頸椎處死小鼠，剝瘤稱重后切取腫瘤組織標本，10%甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋及連續切片（厚度2 μm），EnVision 兩步法染色步驟嚴格按照免疫組化試劑盒（美國DAKO公司，GK500705）說明書方法，PD-L1（美國Abcam公司，ab205921）均按1∶100稀釋加入一抗工作液，以PBS緩沖液代替作為陰性對照組。一抗滴加后孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次加入二抗，孵育30 min后再次沖洗加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況。隨機取3個高倍鏡視野（400×），若染色的細胞數目占腫瘤細胞總數的百分比≥1%，則定義為陽性，否則為陰性[5]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計量資料均符合正態分布，以均數±標準差（）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠瘤體體積和抑瘤率比較

造模后7 d，模型組小鼠瘤體生長較快，而PD-1抑制劑組、艾坦組和聯合組小鼠瘤體生長較慢，與模型組比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。造模14 d，模型組小鼠瘤體迅速生長，而PD-1抑制劑組、艾坦組和聯合組小鼠瘤體生長受到明顯抑制，與模型組比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；聯合組小鼠瘤體明顯小于PD-1抑制劑組、艾坦組（P＜ 0.05）。造模21、28 d，模型組小鼠瘤體生長速度放緩，PD-1抑制劑組、艾坦組和聯合組小鼠瘤體生長速度受到抑制，與模型組比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；聯合組小鼠瘤體明顯小于PD-1抑制劑組、艾坦組（P＜ 0.05）。造模后28 d，聯合組抑瘤率明顯高于PD-1抑制劑組、艾坦組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1、圖1。

圖1 腫瘤體積生長曲線

表1 造模后各組腫瘤體積和28 d抑瘤率比較（）

表1 造模后各組腫瘤體積和28 d抑瘤率比較（）

注 與模型組比較，#P ＜ 0.05；與聯合組比較，*P ＜ 0.05；“-”為無數據；PD-1：程序性死亡受體1；PD-L1：程序性死亡-配體1

組別n腫瘤體積（mm3）28 d抑瘤率（%）t與聯合組抑瘤率P與聯合組抑瘤率7 d14 d21 d28 d模型組8302.85±41.56656.36±45.65725.26±48.28817.65±56.72---PD-1抑制劑組8245.65±38.42#*296.36±42.26#*354.26±45.59#*419.50±51.23#*48.65±5.613.6420.003艾坦組8250.39±41.39#*305.26±55.26#*372.59±51.26#*468.11±60.47#*42.75±6.855.191＜0.001聯合組8205.62±30.26#265.75±42.56#302.56±45.65#340.65±48.62#58.37±5.05--比較值比較值

2.2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較

PD-1抑制劑組和聯合組血清PD-L1和腫瘤PD-L1陽性率均明顯高于模型組和艾坦組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；PD-1抑制劑組和聯合組血清PD-L1和腫瘤PD-L1陽性率比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表2、圖2。

圖2 PD-L1免疫組化結果（400×）

表2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較（）

表2 各組小鼠血清、瘤體組織中PD-L1表達比較（）

注 與模型組比較，*P ＜ 0.05；與艾坦組比較，#P ＜ 0.05；PD-1：程序性死亡受體1；PD-L1：程序性死亡-配體1

組別nPD-L1（mg/L）PD-L1陽性率（%）模型組842.05±8.5235.62±10.24 PD-1抑制劑組8 62.32±9.12*# 65.83±14.35*#艾坦組8 43.75±10.2338.79±11.23聯合組8 65.46±10.82*# 75.63±15.62*#

3 討論

PD-1抑制劑等免疫檢驗點抗體藥物能夠激活效應T淋巴細胞，阻斷腫瘤免疫抑制機制，從而識別并殺死腫瘤細胞[6]，是腫瘤免疫治療的新方法，被批準用于肝癌、腎癌、肺癌等10余種惡性腫瘤的治療，取得一定的效果。艾坦是一款我國自行研制的通過抑制腫瘤血管生成發揮抗癌效果的藥物，目前已在晚期食管癌、胃癌等多種癌癥中應用，Ⅱ期臨床試驗結果顯示艾坦在晚期乳腺癌中取得效果[7-8]。

PD-L1是PD-1的配體，也是B7家族重要成員，而B7家族則是免疫反應中極為重要的協同刺激分子[9]。PD-L1主要在淋巴細胞、內皮細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）及其他重要臟器中表達。相關研究顯示，PD-1/PD-L1通路對T細胞、Til、DC等均具有不同的調控作用[10]。PD-1/PD-L1在肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中均有表達[11]。黃婉瑩等[12]研究證實，TNBC患者腫瘤細胞中PD-1、PD-L1高表達，且與淋巴結轉移、TILs表達呈正相關。腫瘤微環境及腫瘤細胞通過上調PD-L1表達與CD8+T細胞表面的PD-1結合限制免疫反應[13]。對于腫瘤細胞上調PD-L1表達的途徑，主要有以下幾個觀點：①編碼PD-L1的基因擴增；②PI3K-AKT通路、EGFR/MAPK通路、INFγ-JAK-STAT通路等激活，活化與PD-L1基因啟動因子相關的轉錄因子[14]；③EB病毒誘導；④表觀遺傳學機制。

祝夢姣等[15]研究顯示，抗PD-1/PD-L1免疫檢查點的雙重阻滯可能是TNBC免疫治療的突破口。鐘戀君等[16]研究認為PD-L1可作為TNBC的治療靶點及預后生物標志物。佟玲等[17]研究顯示，阿帕替尼通過抑制乳腺細胞癌ERK1/2信號通路，抑制乳腺癌小鼠瘤體的生長。本研究從PD-1抑制劑和艾坦聯合干預出發，探討其抗腫瘤效果。對各組小鼠瘤體體積和抑瘤率的觀察和比較發現，PD-1抑制劑、艾坦干預的TNBC小鼠模型瘤體生長受到明顯抑制，聯合組抑制效果更加明顯，證實PD-1抑制劑聯合艾坦在TNBC小鼠的抗腫瘤治療中能夠起到協同的作用。腫瘤細胞PD-L1表達水平越高，表示腫瘤通過PD-1/PD-L1信號通路發生免疫逃逸的可能性就越高[18]，因此PD-L1可作為PD-1抑制劑治療效果的預測因子。本研究中，PD-1抑制劑組和聯合組血清PD-L1表達水平明顯高于模型組和艾坦組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），證實PD-1抑制劑在TNBC模型小鼠的干預中發揮良好的效果。而艾坦組血清PD-L1表達水平與模型組比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），提示艾坦通過其他方面的機制進行抗腫瘤治療，與PD-1抑制劑作用機制重合的可能性較低。

本研究不足之處在于并未對PD-1抑制劑可能的作用機制展開深入的研究，在今后的研究中著重于此展開研究。

綜上所述，PD-1抑制劑聯合艾坦在TNBC治療中具有協同抗腫瘤作用，能有效抑制腫瘤生長，能為TNBC治療提供新的思路。