蛇傷膠囊對竹葉青蛇傷兔血小板活化功能影響的研究

邵 丹 吳 暉 梁志奇 吳 丹 陳宏杰 王 榕

福建中醫藥大學附屬人民醫院急診科，福建福州 350004

竹葉青蛇是我國常見的一種血循毒類毒蛇，被竹葉青蛇咬傷的患者表現為咬傷處出血，皮膚可見散在的血水皰或瘀斑，傷肢腫痛明顯。前期研究[1-2]表明具有瀉火解毒作用的蛇傷膠囊治療竹葉青蛇傷臨床療效顯著，其作用機制與改善血小板形態及其聚集功能密切相關。血小板發生變形、黏附、聚集及活性物質釋放反應是血小板活化的重要表現，是機體止血、凝血和血栓形成過程的重要環節[3]。αⅡb整合素（CD41）、整合素β鏈Ⅲ（CD61）、血小板P選擇素（CD62P）、溶酶體顆粒膜糖蛋白（CD63）、膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）是血小板活化的特異性指標，本研究擬通過觀察蛇傷膠囊對上述血小板活化相關指標的影響，探尋其糾正竹葉青蛇傷相關凝血障礙的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取24只雄性新西蘭大白兔，體重2.0 kg，廠家：杭州醫學院，許可證號碼：SCXK（浙）2019-0002。本研究經福建安布瑞實驗動物倫理委員會審核批準（審批號：IACVC FJABR2022021001）。

1.2 實驗藥物

蛇傷膠囊（閩藥制字Z06106044，規格：0.37 g×50粒/瓶）為福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑，組成：大黃、黃連、山慈菇、土木香、白芷、雄黃、冰片等，成人用量5粒/次，4次/d。竹葉青蛇毒凍干粉由鷹潭志遠蛇業科技有限公司提供（批號：BS114-10g）。

1.3 實驗試劑

血液RNA提取試劑盒由北京百泰克生物技術有限公司提供（批號：RP4001），Plus All-in-one 1st Strand cD DNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）、SYBR qPCR SuperMix Plus由蘇州近岸蛋白科技股份有限公司提供（批號分別為E047-01A、E096-01B）；DEPC處理水由大連美侖生物技術有限公司提供（批號：MA0018）；GPⅡb/Ⅲa由上海化邦生物科技有限公司提供（批號：HB-T21367P）。

1.4 實驗儀器

DW-HL340超低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫科技股份有限公司），WTL-4K低速迷你離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），Microfuge-22R微量冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司），7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司），MultiskanFC型號酶標儀（賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 藥劑制備及動物用量

實驗中新西蘭大白兔給藥劑量依據實驗動物與人體每公斤體重劑量折算系數表[4]換算，結合既往實驗結果[2]確定所用蛇傷膠囊適宜的劑量為348 mg（/kg·d）。臨用時用蒸餾水配成適當濃度藥液，一般按20～25 ml/（ 只·d） 灌胃，即10 ml/（ kg·d）（成年兔子體重2～2.5 kg），對照組用等量蒸餾水灌胃。

2.2 模型建立及實驗分組

竹葉青蛇傷兔模型參照前期實驗[2]進行復制，健康新西蘭大白兔，體重2.0～2.5 kg，常規飼養1周。將凍干竹葉青蛇毒用滅菌生理鹽水先配制成1 mg/ml的蛇毒生理鹽水母液，按每公斤體重0.75 mg計算出所需的母液體積，然后用滅菌生理鹽水稀釋至總量20 ml，由兔耳緣靜脈緩慢注入。局部出現紅腫提示造模成功。

24只實驗兔常規飼養1周，按隨機數表法根據體重分為3組，每組各8只，雌雄各半。①正常對照組：兔耳緣靜脈注射0.75 mg/kg生理鹽水，6 h后予10 ml/（kg·d）生理鹽水灌胃。②模型組：兔耳緣靜脈注射0.75 mg/kg竹葉青蛇毒液，6 h后予10 ml/（kg·d）生理鹽水灌胃。③蛇傷膠囊組：兔耳緣靜脈注射0.75 mg/kg竹葉青蛇毒液，6 h后予10 ml/（kg·d）蛇傷膠囊所配藥液灌胃。以上3組連續灌胃1周。

2.3 血小板分離提取

用肝素抗凝管兔耳緣靜脈采血5 ml，分裝至離心管中，加入臺氏緩沖液（Tyrode-Buffer）3 ml，后按照1∶1000的比例加入PGE1，在160×g離心力條件下離心12 min，接著移取富含血小板的上層血漿至新的離心管中，按1∶1000的體積加入PGE1，在475×g離心力條件下離心10 min，倒掉上清，每管加入1 ml緩沖液，輕柔地用巴氏吸管吹打重懸血小板。

2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）檢測CD41、CD61、CD62P、CD63信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達

上述血小板重懸后，采用Trizol法提取細胞總RNA并反轉錄為互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），根據NovoStart?SYBR qPCR 試劑盒說明書制備qPCR反應體系，反應參數為95℃ 1 min、95℃ 20 s、56℃ 20 s、72℃ 38 s，40個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3’，下游引物5’-AGCATCGAAGGTAGAGGAGTG-3’，CD41上游引物5’-CCTCAAAGTGGAGCACACCT-3’，下游引物5’- GTGGGCAGCCTCCAGTTTAT-3’，CD61上游引物5’- AGCAGTGACTTCGGCAAGAT-3’，下游引物5’-GTCCAGTCGGAGTCACACAG-3’，CD62P上游引物5’-TGTCCTGTAGGCACCATCTG-3’，下游引物5’-CTGCTGTCCATTGTCCTGAAG-3’，CD63上游引物5’-GCCATTGCTGGTTACGTGTT-3’，下游引物5’- GCCCAGTCCGTGTAGTTAGC-3’，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算CD62P的mRNA表達量。引物合成由福州尚亞生物公司完成。

2.5 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測GPⅡb/Ⅲa水平

按試劑盒說明書標準操作，完成后根據標準曲線公式計算樣品濃度，得出GPⅡb/Ⅲa水平。

2.6 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。P＜ 0.05為差異有統計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統計學意義。

3 結果

各組血小板細胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達及GPⅡb/Ⅲa水平組間比較，差異均有顯著統計學意義（P＜ 0.01）。與正常對照組比較，模型組CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達及GPⅡb/Ⅲa水平顯著降低，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），蛇傷膠囊組CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達顯著降低，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），GPⅡb/Ⅲa水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，蛇傷膠囊組CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達顯著增加，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），GPⅡb/Ⅲa水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組血小板細胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達及GPⅡb/Ⅲa水平比較（）

表1 各組血小板細胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達及GPⅡb/Ⅲa水平比較（）

注 與正常對照組比較，aP ＜ 0.01、cP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.01、dP ＜ 0.05；CD41：αⅡb整合素；CD61：整合素β鏈Ⅲ；CD62P：血小板P選擇素；CD63：溶酶體顆粒膜糖蛋白；GPⅡb/Ⅲa：膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa

組別nCD41CD61CD62PCD63GPⅡb/Ⅲa正常對照組81.01±0.081.00±0.070.99±0.051.00±0.060.66±0.11模型組8 0.34±0.02a 0.36±0.01a 0.43±0.03a 0.17±0.01a 0.47±0.06a蛇傷膠囊組8 0.68±0.03ab 0.66±0.03ab 0.74±0.03ab 0.46±0.02ab 0.56±0.09cd F值347.758377.362412.1021058.3749.289 P值0.0000.0000.0000.0000.001

4 討論

全球每年約有540萬人被毒蛇咬傷，年死亡人數近10萬人[5]。毒蛇咬傷具有起病急、進展快、并發癥多等特點，如果未能進行有效早期救治，致殘率和致死率較高。福建省是毒蛇咬傷高發省份，竹葉青蛇是主要傷人的蛇種之一[6]，血循毒素是其毒液有效成分，其中蛇毒蛋白酶通過直接或間接地作用于血管壁，破壞血管壁的結構，誘導緩激肽、組胺、5-羥色胺等物質的釋放，直接破壞毛細血管內皮細胞，阻斷血小板聚集而導致出血[7]。血循毒素在抑制血小板的聚集的同時，又促進血小板凝固，并且在促凝過程中消耗大量血小板，引起急性皮下廣泛出血[8]，表現為傷口局部腫脹、疼痛、出血，皮膚可見散在血水皰和瘀斑，患肢明顯腫痛。

骨髓中巨核細胞質脫落下來的無核細胞就是血小板，其在出血和凝血過程中起重要作用。正常情況下，在循環血液中，血小板以一種非活化的靜息狀態存在，在各種因素刺激作用下，血小板被活化，發生形態轉變，介導血小板黏附、聚集、釋放反應[9]。CD41（GPⅡb）、CD61（GPⅢa）歸屬于細胞黏附受體整合素家族，可與纖維蛋白原、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）等相結合，發揮促進血小板黏附、聚集等作用[10]。在靜止狀態的血小板中，CD41和CD61各自分布于血小板膜表面，血小板活化后，二者相結合形成GPⅡb/Ⅲa復合物存在于血小板膜表面，作為一種跨膜的糖蛋白信號受體，其可在質膜上進行雙向傳遞生物信息。“由內向外”的信號轉導引起GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原等物質的親和力增加，并促進“由外向內”的信號放大，在血小板與纖維蛋白原的連接過程中發揮橋梁作用，進而引起血小板功能發生一系列變化，在血小板功能、止血和血栓形成中發揮重要作用[11-12]。研究提示血小板被激活后，GPⅡb/Ⅲa表達水平與出血程度呈負相關，血小板活化反應越弱，出血風險越高[13]。CD62P及CD63均屬于血小板的膜糖蛋白，其中CD62P是位于血小板α顆粒內的膜糖蛋白、CD63是血小板溶酶體膜上的顆粒糖蛋白，在未激活的血小板表面很少表達。當血小板被激活后，CD62P、CD63能夠隨著血小板脫顆粒在血液中大量表達，當其表達過高，則能迅速促進血栓形成，是體現血小板活化情況的重要指標[14-15]。楊家慧等[16]研究分析了CD62P、CD63表達水平與血栓彈力圖相關參數的關聯，發現CD62P水平與血小板聚集率呈正相關、CD63水平與凝血反應時間R呈負相關。溫軍祥等[17]研究發現血小板活化因子CD62P、CD63與血小板計數呈負相關，說明血小板活化與血液凝血異常有關。

《普濟方·蛇傷》云：“夫蛇，火蟲也。熱氣炎極，為毒至甚”。竹葉青蛇傷以局部紅腫熱痛為主要表現，屬中醫毒蛇咬傷火毒證范疇，火毒之邪迫血妄行、耗血動血，腐敗肌膚，因此火毒損絡是竹葉青蛇傷的主要病機，瀉火解毒法是治療竹葉青蛇傷的基本治法。

臨床研究[18-19]發現應用具有瀉火解毒作用的蛇傷涼血合劑、黃連解毒湯合犀角地黃湯均可有效抑制竹葉青蛇傷所致的凝血酶時間、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間延長及纖維蛋白減少，增加血小板計數，有效防治竹葉青蛇傷導致的機體凝血功能障礙，緩解患肢腫脹疼痛等癥狀。蛇傷膠囊由大黃、黃連、山慈菇、楊梅皮、土木香、京大戟、白芷、冰片等藥物組成，可直降其火，散臟腑經氣之熱邪，清解氣血的火毒以平熱，具有瀉火解毒的功效，切合竹葉青蛇傷火毒損絡的病變特點，組方用藥體現了《黃帝內經》“熱者寒之”的正治之法，在臨床應用中能夠明顯緩解患處疼痛與腫脹癥狀，改善血小板水平，臨床應用療效肯定[20]。本研究結果顯示，竹葉青蛇傷模型中血小板細胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表達及GPⅡb/Ⅲa水平顯著降低，提示竹葉青蛇傷時血小板活化功能受抑制，蛇傷膠囊可通過提高CD41、CD61、CD62P、CD63、GPⅡb/Ⅲa水平減輕竹葉青蛇傷導致的血小板活化功能抑制，促進血小板活化，減輕葉青蛇傷所致的凝血障礙，蛇傷膠囊調控血小板活化功能具體機制還有待進一步研究。