LC-HRMS/MS研究富馬酸替諾福韋二吡呋酯片中聚合物

肖 穎 王健松▲ 袁 曉 林順權 葉心睿

1.廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣東廣州 510515；2.廣州牌牌生物科技有限公司，廣東廣州 510530；3.廣州白云山明興制藥有限公司，廣東廣州 510250

富馬酸替諾福韋二吡呋酯為美國Gilead Sciences Inc.公司1988年開發，2001年在美國首次上市，適應證為艾滋病病毒（human immunodificiency virus，HIV）感染，2008年增加乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染適應證。富馬酸替諾福韋酯為鏈末端終止劑，經水解，磷酸化形成二磷酸替諾福韋，與天然底物5’-三磷酸脫氧腺苷競爭，整合DNA后終止DNA鏈，從而抑制HIV-1反轉錄酶和HBV反轉錄酶的活性[1-2]。該藥具有耐受性好、耐藥性低、停藥反跳率低、腎毒性小等特點[3-4]。對HIV感染患者，富馬酸替諾福韋二吡呋酯療效優于拉米夫定。對HBV感染患者，富馬酸替諾福韋二吡呋酯療效優于拉米夫定和阿德福韋酯[5]。聚合物雜質目前在抗生素研究中最為關注，主要包括二聚體、三聚體以及多聚體等，是引起過敏反應最可能的一個過敏源。對于有可能產生聚合物的藥物進行聚合物的研究及控制，能很好地減少過敏反應的發生。富馬酸替諾福韋二吡呋酯的結構及合成工藝顯示有產生聚合物的可能，劉超等[6-7]對該藥的雜質有定性研究，均未涉及聚合物。各類藥物雜質譜分析中液-質聯用技術已廣泛采用，尤其是抗生素類的雜質分析中[8-15]。本研究采用液相色譜-高分辨質譜串聯（liquid chromatography high resolution mass spectrometry tandem，LC-HRMS/MS）法研究富馬酸替諾福韋二吡呋酯片中潛在的聚合物，并推斷其結構，為富馬酸替諾福韋二吡呋酯制劑的聚合物雜質控制提供參考，以減少臨床過敏反應的發生。

1 材料

1.1 儀器

Q EXACTIVE Focus型質譜儀和Ultimate3000 DGLC雙三元液相色譜（賽默飛世爾科技），工作站：Thermo Xcalibur Qual Browser 4.0。QUINTIX125D-1CN電子天平和PB-10酸度計[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

富馬酸替諾福韋二吡呋酯片（效期末，白云山制藥總廠，批號：01171001，規格：0.3 g）；替諾福韋酯雜質J（IP）（廣州牌牌生物科技有限公司，批號：PITNFWZ-J-WHO-20191026-01）；替諾福韋酯三聚體雜質2（廣州牌牌生物科技有限公司，批號：PITNFWZ-SJT-2-20191025-01）；乙腈、甲酸均為質譜純（美國ThermoFisher Scientific公司），冰醋酸（江蘇強盛功能化學股份有限公司），氫氧化鈉（天津市津東天正精細化學試劑廠），二水磷酸二氫鈉（天津市福晨化學試劑廠），十二水磷酸氫二鈉和醋酸銨（福晨（天津）化學試劑有限公司）為分析純，水為自制純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

①自制制劑：取本品1片，置100 ml量瓶中，加pH值為3.0的磷酸水（量取超純水1 L，加磷酸調節pH值至3.0）60 ml，充分振搖使崩散，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。②雜質對照品定位溶液：稱取雜質對照品替諾福韋酯雜質J（IP）和替諾福韋酯三聚體雜質2約1.0 mg，用50%乙腈水溶解并稀釋至10 ml，使其濃度約為0.10 mg/ml，作為雜質對照品定位溶液。③未破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。④酸破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，室溫避光放置24 h。⑤堿破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 ml，放置10 min，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。⑥高溫破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，于80℃避光下放置60 min。⑦氧化破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加30%雙氧水25 ml，再加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。⑧光破壞溶液：稱取制劑約0.23 g，置50 ml容量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，于光照箱5000lx下放置29 h，搖勻。⑨稀釋劑：0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH值至3.0）∶乙腈（6：4）。

2.2 LC-HRMS/MS色譜條件（大氣壓化學離子化（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）

儀器：Q EXACTIVE Focus型質譜儀（賽默飛世爾科技）；APCI+模式；噴霧電壓3.8 kV；金屬毛細管溫度320℃；鞘氣壓力60 arb；輔助氣壓力10 arb；噴霧溫度350℃。色譜柱：Inertsil Pheny1-3，4.6×100 mm，3 μm；檢測波長：262 nm；流速：1.5 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μl；流動相A：0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調節pH值至4.6）-乙腈（97：3）；流動相B：0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調節pH值至4.6）-乙腈（40：60）。進樣前預平衡10 min。梯度洗脫見表1。

表1 洗脫條件（%）

2.3 檢測結果（APCI離子源）

取“2.1”項下樣品溶液，按“2.2”項下條件，進行LC-HRMS/MS測定，結果見表2，典型圖譜見圖1。

圖1 APCI離子源下制劑LC-HRMS/MS典型圖譜

表2 供試品破壞性試驗及雜質對照品液質聚合物測定結果

2.4 LC-HRMS色譜條件[電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）]

儀器，色譜柱條件同“2.1”，僅離子源改變，梯度洗脫見表1。

2.5 檢測結果（ESI離子源）

取“2.1”項下自制樣品溶液，按“2.4”項下條件，進行LC-HRMS/MS測定，結果見表3，典型圖譜見圖2。

圖2 ESI離子源下制劑LC-HRMS/MS典型圖譜

表3 自制樣品液質聚合物測定結果

2.6 聚合物雜質結構

2.6.1 聚合物（818）結構 聚合物（818）的準分子離子峰[M+H]+為819.26，推斷結構見圖3，液質結果分析見表4。聚合物（818）的準分子離子峰與理論計算誤差＜5 ppm，與所述結構一致，同時根據有關物質相對保留時間，確認為雜質W。

圖3 聚合物（818）結構

表4 聚合物（818）的液質結果分析

2.6.2 聚合物（934）結構 聚合物（934）的準分子離子峰[M+H]+為935.31，推斷結構見圖4，液質結果分析見表5。聚合物（934）的準分子離子峰與理論計算誤差＜5 ppm，與所述結構一致，同時根據有關物質相對保留時間，確認為雜質S。

圖4 聚合物（934）結構

表5 聚合物（934）的液質結果分析

2.6.3 聚合物（1050）結構及二級裂解 聚合物（1050）的準分子離子峰[M+H]+為1051.36，推斷結構見圖5，液質結果分析見表6。聚合物（1050）的準分子離子峰與理論計算誤差＜5 ppm，與所述結構一致。二級質譜裂解見圖6。

圖5 聚合物（1050）結構

圖6 聚合物（1050）二級裂解圖

表6 聚合物（1050）的液質結果分析

2.6.4 聚合物（1581）結構及二級裂解 聚合物（1581）的準分子離子峰[M+H]+為1582.53，推斷結構見圖7，液質結果分析見表7。聚合物（1581）的準分子離子峰與理論計算誤差＜5 ppm，與所述結構一致。二級裂解見圖8。

圖7 聚合物（1581）結構

圖8 聚合物（1581）二級裂解圖

表7 聚合物（1581）的液質結果分析

3 討論

富馬酸替諾福韋二吡呋酯為臨床多用的抗HIV、HBV藥，副作用小、耐藥性低。根據結構及合成工藝可能產生過敏反應的來源之一的聚合物，有必要對其進行研究及控制，減少臨床中過敏反應的發生。文獻多報道該藥物的雜質定性研究，尚無該藥聚合物的研究報道。

目前已報道的藥物聚合物檢測方法主要包括葡聚糖凝膠G10色譜法、尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）、二維柱切換質譜聯用法等，本研究通過LC-HRMS/MS對其聚合物進行定性研究，分別選用APCI離子源和ESI離子源對效期末和破壞樣品的聚合物雜質進行檢測分析，確定聚合物雜質的結構。研究檢出有二聚體：聚合物（1050）-雜質H，聚合物（818）-雜質W，聚合物（934）-雜質S；三聚體：聚合物（1581）-富馬酸替諾福韋二吡呋酯三聚體雜質2。雜質H由兩分子替諾福韋二吡呋酯與另外一分子酯基的亞甲基反應生成；雜質W由兩分子替諾福韋單吡呋酯與另外一分子酯基的亞甲基反應生成；雜質S由替諾福韋二吡呋酯與替諾福韋單吡呋酯及另外一分子酯基的亞甲基反應生成，三個雜質均可由原料藥引入或制劑中降解生成。三聚體雜質推測為原料中雜質H進一步與替諾福韋二吡呋酯在殘留甲醛下共同聚合產生，減少殘留甲酫的量能降低三聚體產生的概率。二聚體、三聚體為該藥物過敏不良反應的源頭，對聚合物進行控制能有效減少過敏反應的發生。

由于聚合物多不穩定，本研究僅對樣品中穩定存在的聚合物進行了定性研究，為富馬酸替諾福韋二吡呋酯制劑的反相高效液色譜法進行雜質定量控制提供參考依據。隨著檢測技術的不斷提高，對聚合物的研究會更深入。