基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討二至丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的作用機(jī)制

簡萬妍 王艷群 陳美玲 曾 莉

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，貴州貴陽 550001

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）[1]指的是女性在40周歲以前發(fā)生的一種生殖內(nèi)分泌疾病，以月經(jīng)稀發(fā)、頻發(fā)甚至閉經(jīng)，生育力下降甚至不孕或出現(xiàn)潮熱盜汗等為主要臨床癥狀，并伴隨卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平升高（FSH＞25 IU/L）、雌激素水平降低。相關(guān)研究表明POI在育齡期女性中發(fā)生率為1%～5%[2]。目前相關(guān)的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究提出POI的發(fā)病可能與自身免疫力、感染、環(huán)境等因素相關(guān)，其臨床治療方法局限且治愈難度大[3]。

縱觀書海，古代醫(yī)學(xué)尚未談及“早發(fā)性卵巢功能不全”，根據(jù)POI的臨床特征，可以把它劃為“月經(jīng)病”“經(jīng)斷前后諸證”等范疇。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法與分子對(duì)接技術(shù)，闡述二至丸防治POI藥物成分的作用機(jī)制，并為其提供基本生物學(xué)信息依據(jù)，為尋求POI新的治療方法提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 二至丸靶點(diǎn)篩選

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com）中獲得復(fù)方藥物的活性成分。運(yùn)用蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）將蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱，建立中藥-成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.2 POI靶點(diǎn)篩選及處理

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://mirror.omim.org/）查找POI的靶點(diǎn)基因。

1.3 二至丸治療POI的靶點(diǎn)預(yù)測

將POI靶點(diǎn)與二至丸相同靶點(diǎn)用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖。把共同靶點(diǎn)輸進(jìn)STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）后構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），使用Cytoscape 3.10.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行可視化，分析后根據(jù)度值（Degree）大小排序構(gòu)建藥物-疾病PPI圖。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將最終篩選出的共有靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），分別將GO的生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功效（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cell component，CC）KEGG富集通路引出并整理。通過微生信（www.bioinformatics.com.cn）平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

1.5 藥物-成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將二至丸中對(duì)應(yīng)的活性成分、成分靶點(diǎn)和富集的通路等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.10.0軟件中，繪制出“藥物-成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）選出核心小分子結(jié)構(gòu)，使用PDB數(shù)據(jù)庫（http://www1.rcsb.org/）獲取相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白文件。運(yùn)用AutoDockTools 1.5.6進(jìn)行對(duì)接，并采用Pymol軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 二至丸活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選兩味中藥材的活性成分，共篩選出二至丸中藥活性成分墨旱蓮10個(gè)，女貞子8個(gè)，共同者有2個(gè)（Luteolin、Quercetin），基本信息見表1。將TCMSP數(shù)據(jù)庫和UniProt信息匹配，最后得到二至丸對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)為198個(gè)。

表1 二至丸活性成分

2.2 二至丸活性成分和靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.10.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視圖的構(gòu)建（圖1），整個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖由212個(gè)節(jié)點(diǎn)和405條邊構(gòu)成。A1、A2代表兩個(gè)藥物的共同成分，NZZ1-6表示女貞子的6個(gè)有效成分；MHL1-8表示墨旱蓮的8個(gè)有效成分。

圖1 “二至丸-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 POI靶點(diǎn)篩選

將GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中獲取到的疾病關(guān)聯(lián)基因歸納后，共獲取POI基因1815個(gè)。利用Venny 2.1.0對(duì)198個(gè)靶點(diǎn)基因和1815個(gè)靶點(diǎn)分析制圖，取交集后共獲得107個(gè)共同基因（圖2）。

圖2 二至丸-POI靶基因Venny圖

2.4 二至丸治療POI的靶點(diǎn)預(yù)測

把處理后的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.10.0以建立PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），其包括節(jié)點(diǎn)107個(gè)，邊線1695條。節(jié)點(diǎn)越大代表其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要，再使用CytoHubba插件篩選前十位的靶點(diǎn)（圖4）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI中的關(guān)鍵蛋白

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將二至丸治療POI的核心靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID進(jìn)行GO富集分析，分別取BP、CC、MF的-lgP值前十位構(gòu)建條形圖（圖5）。GO分析結(jié)果表明，BP主要包括轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、正向調(diào)控細(xì)胞增殖等。CC的結(jié)果顯示主要與細(xì)胞核、細(xì)胞外間隙等關(guān)聯(lián)。MF主要包含與蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等。KEGG富集分析得到的信號(hào)通路有腫瘤相關(guān)通路、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等（圖6）。

圖5 二至丸治療POI的GO富集分析

圖6 二至丸治療POI的KEGG富集分析

2.6 藥物-成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

使用Cytoscape 3.10.0軟件，形成藥物-成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。A1、A2代表兩個(gè)藥物的共同成分，NZZ1-6表示女貞子的6個(gè)有效成分；MHL1-8表示墨旱蓮的8個(gè)有效成分。圓形為靶點(diǎn)基因，POI外的八邊形為通路。

圖7 “二至丸-活性成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)分子對(duì)接方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行研究，選取degree值靠前的槲皮素、木犀草素2種關(guān)鍵活性成分與degree值較大的關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、PTGS1進(jìn)行對(duì)接，見表2，結(jié)果顯示槲皮素與PTGS2，木犀草素與PTGS2、PTGS1存在較好的親和力（圖8）。其中木犀草素與PTGS2結(jié)合最為密切，結(jié)合能為-5.87 kJ/mol。結(jié)果顯示二至丸核心成分與靶蛋白具有較好的親和力，可能通過這些靶點(diǎn)治療POI。

圖8 二至丸有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接情況

表2 二至丸主要成分靶點(diǎn)和分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

POI是指女性在40周歲以前出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、頻發(fā)甚或閉經(jīng)、FSH＞25 U/L，雌激素水平降低等卵巢功能下降的疾病[1]。相關(guān)研究顯示，其主要與遺傳性因素、免疫因素、醫(yī)源性因素、環(huán)境因素等有關(guān)[4]。當(dāng)前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療POI更多選擇激素替代治療，長期使用激素替代療法會(huì)增加罹患女性相關(guān)癌癥（如乳腺癌）的可能，故用藥過程需定期評(píng)估，因而在臨床應(yīng)用中受限。歷代名醫(yī)指出婦女在經(jīng)斷時(shí)期體內(nèi)腎氣虧損，陰陽失衡，最后引起各臟腑功能下降，腎虛為該病的基本病機(jī)[5]。女貞子有滋陰益壽、補(bǔ)益肝腎等功效；墨旱蓮具有溫補(bǔ)肝腎、涼血的功效。以上藥物味平，補(bǔ)而不膩，是平補(bǔ)肝腎之經(jīng)典名方。

本研究共篩選出16個(gè)二至丸潛在活性成分，根據(jù)拓?fù)涑龅暮诵墓?jié)點(diǎn)，槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素是二至丸作用于POI的4個(gè)主要成分。槲皮素是人體飲食中最豐富的類黃酮之一，而近年來的科學(xué)研究也證實(shí)了其具有優(yōu)異的抗氧化功能，表現(xiàn)在能夠控制氧化呼吸鏈的擴(kuò)散和抑制自由基產(chǎn)生等[6]。既往實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素的抗氧化活性主要是經(jīng)過調(diào)整身體中谷胱甘肽的劑量、氧化反應(yīng)相關(guān)酶的活性和氧化應(yīng)激信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[7]。黃長盛等[8]的研究數(shù)據(jù)說明槲皮素有益于人體各階段卵泡的正常生長發(fā)育，通過刺激可分泌雌激素的顆粒細(xì)胞繁殖以此改善卵巢功能。木犀草素屬于天然黃酮類化合物，據(jù)近年來的科學(xué)研究證實(shí)，木犀草素經(jīng)常以糖苷的形式出現(xiàn)于各種藥物成分和蔬菜水果中，如金銀花、菊花等[9]。研究顯示，其兼顧抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性[10-11]。研究表明，山柰酚是因?yàn)榧せ預(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。刺槐素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，有許多生物功能，包括抗氧化、抗病毒、抗炎抑菌，并且能夠通過各種方式治愈多種癌癥疾病。故本研究預(yù)測二至丸通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素等有效成分改善POI。

PPI網(wǎng)絡(luò)涉及基因節(jié)點(diǎn)107個(gè)，通過拓?fù)浞治鰴z測出重要節(jié)點(diǎn)為AKT1、TP53、VEGFA、TNF等。作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1），基于研究數(shù)據(jù)，指出AKT1在卵巢支持細(xì)胞的代謝、凋亡及細(xì)胞周期的環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用[12]。腫瘤抑制蛋白（tumor protein，TP53）通過減少卵巢中顆粒細(xì)胞的生成及類固醇激素的產(chǎn)生、加速其顆粒細(xì)胞的凋亡，從而致使卵巢功能衰退[13]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）程度與卵巢細(xì)胞生長、分解和萎縮密切相關(guān)，調(diào)控卵泡生長與萎縮、卵母細(xì)胞成熟及排卵[14]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）包含了VEGFA，VEGFA亞型的均衡調(diào)控著卵泡的發(fā)展和黃體產(chǎn)生，亞型的表露能調(diào)控哺乳動(dòng)物的生育能力。

KEGG通路富集分析主要涉及的信號(hào)通路有癌癥相關(guān)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等。細(xì)胞中經(jīng)典的信號(hào)通路是PI3K-Akt，該信號(hào)通路異常表達(dá)時(shí)，在影響原始卵泡規(guī)律發(fā)育的前提下，改變卵巢的正常生理功能，導(dǎo)致卵巢衰老的進(jìn)展迅速。流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路能夠改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的分解、形態(tài)及血管壁的通透性，是由于內(nèi)皮細(xì)胞中基因和蛋白的表達(dá)被破壞而造成的[15]，從而對(duì)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響。借此可猜測該通路損壞卵巢功能的原因是可能是卵巢中的部分血流受損。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，分析了二至丸的活性成分和靶點(diǎn)以及疾病的重要靶點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行分析、構(gòu)建作用網(wǎng)絡(luò)及通路。關(guān)鍵的核心蛋白可以促使原始卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，該作用是通過調(diào)節(jié)與之相關(guān)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。除此之外，它還可能改善卵巢部分血流情況，該作用是通過改變卵巢內(nèi)皮細(xì)胞中基因和蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。由此得出，二至丸是從多成分、多靶點(diǎn)和多通路的角度出發(fā)，通過彼此之間的相互協(xié)作來干預(yù)POI，以此為臨床工作中二至丸治療POI的進(jìn)一步研究提供方法及理論依據(jù)。